无芒隐子草叶片卷曲度和厚度测量方法

张文霞 王春光 王海超 殷晓飞 宗哲英

(1.鄂尔多斯应用技术学院信息工程系，鄂尔多斯 017000；2.内蒙古农业大学机电工程学院，呼和浩特 010018；3.呼和浩特职业学院机电工程学院，呼和浩特 010051)

0 引言

植物叶片是植物进行光合作用的主要场所，其发育状况直接影响植物的生长[1]。植物叶片卷曲度和厚度是反映植物抗旱性的重要指标[2-3]，深入研究这两个参数对揭示植物的生长状况、研究抗旱机制、选育耐旱植物以及实现环境控制具有重要的意义。

叶片几何参数测量方法主要分为直接法和间接法。直接法通过破坏性取样后进行测量，常见的有九宫格法、称重法、求积仪法等[4-5]，该类方法主要依靠人工操作，测量精度低且费时费力，不能进行大规模数据测量；间接法主要利用相关仪器测定参数值[6]，该类方法设备价格昂贵、操作繁琐、维修成本高[7]，且不适合大规模数据测量。随着计算机技术的发展，近年来通过图像处理方式分析和测量植物叶片几何参数的方法备受关注[8-13]。此类方法在确保测量精度的前提下，提高了测量速度，且有助于批量测量。目前，多数学者研究的图像测量方法仅针对平整型植物叶片进行测量，且针对叶面积的测量方法研究较多，而专门针对植物叶片厚度和卷曲度测量的研究却鲜见报道。

本文以无芒隐子草叶片为研究对象，通过石蜡制片获取无芒隐子草叶切片图像，采用红色灰度化方法结合阈值分割将目标和背景分离，在准确分割的基础上，提出采用基于Graham算法的最小外接矩形法实现叶片卷曲度的测量，采用矢量积法和角点检测相结合的凹凸点检测算法实现叶片厚度的测量。

1 材料与方法

1.1 图像采集

无芒隐子草叶片采集的试验样地在鄂尔多斯鄂托克旗境内，东经106°41′～108°54′，北纬38°18′～40°11′，平均海拔1 800 m，该地区气候属于典型的温带大陆性季风气候，日照丰富，四季分明，无霜期短，降水少，全年较干旱。从试验样地中选取4个不同退化梯度样地(对照区CK、轻度退化区LD、中度退化区MD和重度退化区HD)，样区内主要植被包括无芒隐子草(Cleistogenessongorica)、狭叶锦鸡儿(Caraganastenophylla)、短花针茅(Stipabreviflora)、猪毛菜(Salsolacollina)、砂蓝刺头(Echinopsgmelini)等，草地平均高度为8 cm，盖度仅为10%～25%。

于2016年7—8月，分别在4个退化梯度样地随机设立样方40个，样方尺寸为0.5 m×0.5 m，在样方内随机选取同龄级、健康的无芒隐子草叶片30片，将其装入标准固定液(Formalin-acetic acid-alcohol，FAA)，并置于4℃恒温箱保存以备切片。

将无芒隐子草叶片从FAA标准固定液中取出，经软化、脱水、透明、浸蜡和包埋、切片、粘片和烘片、染色、封片等步骤完成石蜡制片[14]，获得永久性玻片，利用生物光学显微镜(YYS-80E型)和配套的图像采集系统CM1400型摄像机结合计算机，采集和存储图像。处理与分析图像的计算机配置为Intel Core i5CPU M480@2.67 GHz，6 GB内存，Windows 7操作系统，图像处理软件采用Matlab 2015a。

1.2 目标与背景分割算法

对试验采集的图像，首先提取图像的R、G、B分量，根据图像特征确定灰度化方法，然后设计矩形结构元素，通过形态学开运算剔除粘连噪声，接着设计滤波器掩模矩阵，进行线性滤波以消除锯齿状边界，最后，采用最大类间方差(Otsu)方法自动选择阈值进行二值处理，实现目标和背景的分割。

1.2.1灰度化

彩色图像灰度化直接影响最终分割精度，常用的灰度化方法有分量法、最大值法、平均法和加权平均法。为了提高算法鲁棒性，需要根据无芒隐子草叶片切片图像的特点选取合适的灰度化方案。

本文随机选取30幅测试图像，R、G、B通道的均值分别为197.7、197.5、190.8。为了较好地实现目标与背景的分离，使用红色特征灰度化方法，但图像中含有较高蓝色B分量，通过增大R、减小G和B[15]来调整三色权重，适合无芒隐子草叶片解剖图像的灰度化方法为

Gray=2.8R-1.1G-1.4B

(1)

式中Gray——灰度

为定量评价本文灰度化方案的有效性，采用图像信息熵(Entropy)、图像平均梯度(Average gradient)和图像对比度(Contrast)3个指标进行评价。

1.2.2形态学开运算

开运算处理可以断开狭小间断和消除细突出物，使对象轮廓变平滑。构造大小为5×20的矩形结构元素H，对灰度化图像I进行开运算。

I∘H=(I⊖H)⊕I

(2)

式中 ∘ ——开运算符号

⊖——腐蚀运算符号

⊕——膨胀运算符号

1.2.3线性滤波

线性滤波可以消除锯齿状边缘，在M×N的图像I上，用大小为m×n的滤波器掩模进行线性滤波，计算公式[16]为

(3)

其中

a=(m-1)/2b=(n-1)/2

式中g(x,y)——滤波输出图像

w(s,t)——空间滤波器

1.2.4最大类间方差

最大类间方差法是一种非参数化的全局阈值分割方法，是图像分割中自动阈值选取的最佳算法[17-18]。

1.2.5分割质量评价

为定量评价算法分割效果，本文在总结现有评价指标的基础上，采用误检率[19](False positive rate，FPR)、漏检率[20](False negative rate，FNR)和整体分割精度(Global segmentation accuracy，GSA)[21]作为评价指标，对算法有效性进行检验，所需的金基准分割图通过Photoshop软件手动分割获得。FPR、FNR值越小，GSA值越大，分割精度越高。

1.3 目标参数测量

叶片卷曲度和厚度是叶片的重要参数指标，其定义如图1所示，叶片卷曲度(LW)为叶片图像中最远两点间的距离；叶片厚度(TL)为叶片上、下角质层之间的距离，在实际测量中，叶片厚度为图像左右边界上凹点与凹点、凸点与凸点之间的距离。在1.2节图像分割的基础上，根据目标参数实际测量方式，采用图像处理的方法实现叶片卷曲度和厚度的测量。

1.3.1叶片卷曲度测量

结合无芒隐子草叶片解剖结构图像轮廓的特点，采用8-邻域边界跟踪算法[22]获得图像边界上所有像素点，应用Graham算法[23-24]构造凸包，搜索叶片解剖结构图像的最小外接矩形(Minimum bounding rectangle，MBR)，从而求出叶片卷曲度。算法的具体步骤为：

(1)采用8-邻域边界跟踪算法提取图像边界，设边界点坐标集为S。

(2)采用Graham算法构造图像轮廓凸包。①寻找S中距离y轴最近的点设为基点P0。②将S中其余点和基点P0构成向量，并根据极角由小到大排序，记为P0,P1,…,Pn，如果有多个相同的极角点，只保留极径最大的点。③将P0、P1、P2入栈。④对任意点Pi，如果栈顶的2个点与其不构成“左旋”关系，则将栈顶的点出栈，直到没有点出栈，再将当前点进栈。所有点处理完之后，最后栈中保存的点为目标图像完整凸包。

(3)提取叶片最小外接矩形。①随机选取凸包左右两端点，设为A(x1,y1)、B(x2,y2)，构成起始边AB，以点A为中心旋转角θ，使该边平行于x坐标轴。②凸包上的所有点围绕点A旋转角θ。③以AB为上(下)边界，找到y值最小(最大)的一个点，经过此点作平行于x轴的直线，这就确定了下(上)边界。然后找到x值最小和最大的左侧点和右侧点，经过这两个点分别做垂直于x轴的两条直线，确定对应的左右边界。这样即可得到一外接矩形，计算并保存边AB、旋转角θ，此时记录外接矩形的顶点坐标和面积。④顺序选择下一条边BC，若此边已经选择，则顺序执行，否则跳转至步骤①，比较所有外接矩形的面积，找出其中面积最小的外接矩形。⑤根据步骤③中的记录，求出叶片的卷曲度。

1.3.2叶片厚度测量

本文在提取叶片外边界的基础上，应用改进的凹、凸点检测算法提取图像外边界的凹点和凸点，最后进行凹点与凹点匹配、凸点与凸点匹配，应用欧几里得距离计算出叶片厚度。

传统矢量积法检测出大量与实际测量不相符的无用点，给后续准确匹配凹凸点带来不便，为获得较为准确的、符合实际测量点的凹点和凸点，本文提出将角点检测和矢量积法相结合的凹凸点检测算法，算法首先采用最小周长多边形近似法获取轮廓顶点，应用自适应阈值和支持动态区域的曲率尺度空间角点检测算法[21]预选出候选的凹凸点，结合矢量积法检测出顶点的凹凸性，剔除角点中非凹、凸点，剩余角点即为有用的凹凸点。算法具体步骤为：①求无芒隐子草叶片解剖结果图像的最小外接矩形，并对其进行旋转，使得长轴平行于y坐标轴。②获取无芒隐子草叶片解剖结构图像最小周长近似多边形和顶点集合Pv(v=1,2,3,…)。③根据矢量积法获取凹点集Pa和凸点集Pt。④填充步骤①中获得的无芒隐子草叶片解剖结构图像的边缘轮廓断裂点，找到T形角点。⑤计算轮廓上每个点的曲率。⑥将局部曲率最大值点设为候选角点，并根据自适应阈值剔除圆角点，同时剔除因噪声和细节产生的伪角点，阈值设定和伪角点判断准则见文献[25]。⑦在较低尺度下对已确定的角点定位。⑧比较T形角点与提取出角点的距离，剔除两个相隔较近的其中一个角点，得到最终正确的角点集C。⑨将C设为候选凹凸点集，分别与Pa和Pt中的点进行距离对比，从而将C中的点分为凹点集C1和凸点集C2。⑩对C1和C2中的点分别按照y坐标的升序排序。以y坐标值最大点为分界点，将C1和C2分别分为左右集合：凹点左集合(C1l)、凹点右集合(C1r)、凸点左集合(C2l)、凸点右集合(C2r)。将C1l与C1r中的点根据距离进行凹点匹配，并求出匹配点之间的欧氏距离，同样，将C2l和C2r中的点根据距离进行凸点匹配，并求出匹配点的欧氏距离，进而求出叶片厚度。

2 试验与结果分析

2.1 灰度化处理

对任意选取的30幅无芒隐子草叶片解剖结构图像进行试验，图2为分别采用不同方法处理后的效果图，由图2可知，采用本文方法处理后，能够明确区分维管束、泡状细胞、叶肉组织等解剖结构，图像对比度明显提升。

表1给出了任意选取的30幅图像经本文方法处理后的图像信息熵、平均梯度、对比度，并与分量法、最大值法、平均法、加权平均法进行对比，结果显示，采用本文方法处理后，图像的各项指标均明显高于其余4种方法处理后的结果。

表1 不同灰度化方法处理效果评价

图3为应用不同灰度化方法对无芒隐子草叶片解剖结构图像灰度化后，经形态学开运算、线性滤波和阈值分割后的分割结果对比图，由图3可知，本文提出的方法使目标分割结果更为完整、准确。

2.2 目标和背景分割试验

图像灰度化处理后，经形态学开运算、线性滤波、阈值分割，获得最终分割结果，如图4所示。试验提取了参照图目标边界(图4e)，并将提取的边界叠加于分割结果图(图4f)，结果显示，分割后的目标区域与目标原边界基本吻合。

表2给出了30幅图像试验的平均误检率、平均漏检率和整体分割精度。由表2可知，平均误检率为0.75%，平均漏检率为3.49%，整体分割精度达到98.14%。结果表明本文算法能够实现目标和背景的精确分割，满足后续特征参数测量需求。

表2 分割效果评价结果

2.3 目标参数测量试验

2.3.1叶片卷曲度测量

图5为目标卷曲度测量试验示例，由图5可知，对于任意朝向的无芒隐子草叶片图像均可以求得其最小外接矩形，最小外接矩形长度与无芒隐子草叶片卷曲度的实际测量方式结果相符。

表3为本文方法测量值与显微镜自带软件ToupTek Toupview交互式多次测量均值对比，由表3可知，本文方法测量值与交互式测量均值平均相对误差为0.96%，速度提高了约10倍，结果表明本文方法可以准确测量无芒隐子草叶片卷曲度。

表3 叶片卷曲度测量值与交互式测量值比较

2.3.2叶片厚度测量

试验过程示例如图6所示，结果显示，传统的矢量积法检测出较多与实际测量不相符的凹凸点(图6d)，本文方法剔除了许多无用点(图6e)，最终实现的凹点与凹点、凸点与凸点之间的连线与实际测量方式相符。

表4给出了30幅测试图像应用本文方法测量与应用显微镜自带软件ToupTek Toupview交互式测量均值对比，由表4可知，通过本文方法测量的平均相对误差仅为3.69%，速度提高了约37倍，说明本文方法可以较为准确地测量无芒隐子草叶片厚度，且极大地提高了效率。

表4 叶片厚度测量值与交互式测量值比较

3 结论

(1)提出了适合无芒隐子草叶片解剖结构图像的红色灰度化方案，并与分量法、最大值法、平均法、加权平均法进行对比，结果表明，本文方法优于其他4种方法。使用最大类间方差结合形态学开运算和线性滤波，实现了无芒隐子草叶片解剖结构图像目标和背景的准确分割，30幅图像分割的平均误检率为0.75%，平均漏检率为3.49%，平均整体分割精度达到了98.14%。

(2)提出了采用Graham算法构造凸包的最小外接矩形法，实现了叶片卷曲度的准确测量。将测量值与交互式测量均值进行了对比，30幅测试图像的平均相对误差为0.96%，速度提高了约10倍。

(3)提出了角点检测和矢量积法相结合的凹凸点检测算法，结合凹点匹配和凸点匹配实现了叶片厚度的准确测量，将测量值与交互式测量均值进行了对比，30幅测试图像的平均相对误差为3.69%，速度提高了约37倍。

(4)本文通过图像处理手段实现了无芒隐子草叶片解剖结构特征参数的提取和测量，克服了人工交互测量效率低、实现性差的缺点。