miR-449a 对体外培养脊髓神经元的影响

吴春妍，陈国娇，王琼仙，王利梅，苏茜茜，石兰岚

（1 昆明医科大学实验动物学部，云南 昆明；2 昆明医科大学基础医学院；云南 昆明）

0 引言

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，患者多表现为功能丧失甚至是损伤平面下的完全瘫痪，致残率极高[1]。由于这种疾病恢复历程极其漫长，他们需要依赖多种医疗措施护理延长寿命，生活质量极差[2]。不仅如此，脊髓损伤的患者还要在整个疾病过程中承受多种渐进性并发症的折磨，比如心血管疾病、肠胃问题、慢性疼痛和抑郁等[3,4]。脊髓损伤后，损伤区域发生复杂的生理病理变化，而神经功能的恢复主要与轴突内生能力/微环境的营养因子与生长因子及瘢痕形成等有密切关系[5]，如何实现功能恢复，是国内外研究的重点和难点。本研究拟将miR-449a 转染脊髓神经元，通过体外培养观察miR-449a 对神经元的作用。

1 材料与方法

1.1 动物和材料

SPF 级新生24h 内的SD 乳鼠，由昆明医科大学实验动物学部提供。倒置显微镜（Nikon SMZ745）、miR-449a mimic、NC（广州锐博）、引物（成都擎科）、RT-qPCR反应试剂盒（DBI Bioscience）、DMEM/Neurobasal 培养基（Gibco）。终止消化，用5ml 吸管轻轻地吹打10次，静置2min，吸取上面的细胞悬液移入培养皿中，然后再向沉淀的组织团块加入培养基，重复上述吹打步骤，吸取上层细胞悬液，如此2-3次。滤网过滤，1000r/min 离心5min，弃上清，加入培养基重悬细胞，移入培养瓶置入37℃培养箱中30min 差速贴壁，收集未贴壁液体调整细胞密度至1×106个/孔，将细胞接种到6 孔板中，每孔2ml，将培养板放入37℃、5%CO2孵箱内孵育[6-8]。每3d 半量换液1次。

1.2.2 细胞转染

按照miRNA 产品使用说明书，以50nM 的miR-449a mimic、NC 终浓度转染脊髓神经元。

1.2.3 RT-qPCR 检测miR-449a、β-tubilin 的表达

使用Trizol 法提取各组的总RNA，在紫外荧光光度计中进行吸光度A260/280 和A260/230 比值的测定以确定样品总RNA 的纯度和浓度，对miRNA 和β-tubilin分别反转录为cDNA。取适量cDNA 为模板配制20μl 反应体系在PCR 扩增仪中进行PCR 反应。使用SYBR 染料实时检测扩增情况，β-tubilin 使用GAPDH 为内参，miRNA 使用U6 为内参分析表达情况，数据采用2-ΔΔCt 法进行分析。引物设计见表1。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取24h 内新生的SD 乳鼠置于75% 酒精中浸泡3-5min。将乳鼠取出后断头、沿正中线剖开，暴露脊柱，置于盛有D-hanks 液的培养皿内，分离脊髓，剥离脊髓上的血管膜和脊膜。将脊髓组织移入10ml 培养皿中，用剪刀剪成0.5-1mm3大小的小块，加入2mg/ml 木瓜酶置于37℃培养箱消化20-30min。用等体积的10%胎牛血清

表1 RT-qPCR 引物列表

1.3 统计方法

使用SPSS 22.0 统计软件进行所有数据进行处理，采用均数±标准差表示。根据实验设计组间比较使用单素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代脊髓神经元状态分析

原代脊髓神经元培养1d 时，可观察到细胞贴壁生长圆而透明，培养至第3d 时，细胞生长良好，胞体丰满、长出细小的突起，胞浆透明、折光良好。

2.2 转染miR-449a 在脊髓神经元中的表达变化

采用RT-qPCR 检测，mimic 组的miR-449a 表达量显著高于NC 组（P＜0.05）。

2.3 转染miR-449a 对β-tubilin 在体外培养脊髓神经元中的影响

采用RT-qPCR 检测β-tubilin 的表达水平，与NC 组相比，mimic 组的β-tubilin 表达水平显著升高（P＜0.05）。见图1。

图1 RT-qPCR 检测脊髓神经元中β-tubilin 的表达情况

3 讨论

脊髓损伤是常见的外伤性神经系统疾病，具有高发病率、高致残率、高花费等特点，患者预后极差，生活质量极低[9,10]。开展脊髓损伤后功能恢复的机制研究，开发精准的治疗药物意义重大。miR-449a 的研究涉及在癌症、神经系统疾病，以及代谢疾病领域，在前期的研究工作中，我们还尝试用iPS 细胞移植治疗脊髓损伤，功能恢复效果显著，并伴随着miR-449a 的表达显著下调[11，12]。不仅如此，我们用生物信息学还预测β-tubilin 是miR-449a 的靶基因。本研究通过体外培养脊髓神经元，利用RT-qPCR 检测miR-449a、β-tubilin 表达变化，发现miR-449a 的上调显著提升了β-tubilin 的表达量，miR-449a 是否通过靶向β-tubilin 在发挥促进脊髓损伤的关键作用及其调控机制还有待于进一步研究。