固相萃取结合薄层色谱法测定蜂蜜中高果糖淀粉糖浆

马凯，杨昌彪*，黄永桥，吴新文，简银池

(1.贵州省分析测试研究院，贵阳 550000；2.贵州省检测技术研究应用中心，贵阳 550000)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]，其主要成分为果糖、葡萄糖、氨基酸、维生素、矿物质和酶[2]，具有丰富的营养价值，是良好的药用辅料，并作为食品调味配料应用于多种食品中[3-6]。近些年来，随着人民的生活水平提高，对于蜂蜜的需求量迅速增加，但是天然蜂蜜的产量难以满足市场需求，价格相对较高，少数不法商人在天然蜂蜜中掺加各种低廉的糖浆，如果葡糖浆、麦芽糖浆等，以此牟利，严重损害了消费者和正规蜂蜜生产企业的利益[7]，因此，有必要对蜂蜜掺假与真伪的检测技术进行研究。目前，蜂蜜掺假检测方法已由感官、理化指标、花粉鉴别等传统品质检测方法[8]，发展到现代分析技术，主要有碳稳定同位素分析法、色谱分析法、光谱分析法、酶活性法、差热分析法等[9-15]，这些检测方法都有各自的特点和一定的适用范围。其中，薄层色谱法由于对设备和操作要求较低，且对蜂蜜中掺入的高果糖淀粉糖浆能准确辨别，被广泛应用，我国也在美国AOAC方法《蜂蜜中高果糖淀粉糖浆——薄层色谱测定法》进行了编辑性修改，形成了GB/T 18932.2-2002《蜂蜜中高果糖淀粉糖浆测定方法 薄层色谱法》国家标准方法。

本研究在GB/T 18932.2-2002标准方法的基础上，拟采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃层析柱，对前处理步骤进行优化，再用薄层色谱法分离、检测，建立了蜂蜜中高果糖淀粉糖浆的测定方法。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

无水乙醇、丙酮：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；正丁醇(分析纯)：天津市富宇精细化工有限公司；冰乙酸(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸(优级纯，≥85%)：国药集团化学试剂有限公司；二苯胺盐酸盐、苯胺：分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为一级水；F55果葡糖浆：山东香驰健源生物科技有限公司；原料为食用玉米淀粉。

薄层展开剂的配制：正丁醇+水+乙酸(2+1+1)。

显色剂的配制：称取1.0 g二苯胺盐酸盐，至盛有50.0 mL丙酮的锥形瓶中，再加入1 mL苯胺，同时加入5 mL磷酸，超声至完全溶解，冷冻保存或临用前配制。

薄层层析板：硅胶G板(青岛海洋化工有限公司，规格200 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm)，使用前应画板，在距离薄层板下端2.0 cm的位置画线，此线为爬板起始线，在薄层板的左右两边各留2 cm，并在起始线上水平每间隔2 cm处标记，作为点板位置，从起始线向上量10 cm的位置画线，此线为爬板终点线，层析板使用前应置于110 ℃恒温干燥箱中活化1 h，并置于干燥器中冷却至室温，备用；固相萃取小柱(规格6 mL)：上海安谱实验科技股份有限公司；微量注射器(10 μL)：美国安捷伦公司；显色喷雾瓶(规格50 mL)：姜堰东方科教仪器厂；50 mL棕色鸡心瓶；薄层色谱展开槽(200 mm×200 mm，双槽)。

1.2 仪器与设备

202型电热恒温干燥箱 永光明医疗仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；真空抽气泵(SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵)；分析天平 常熟市天量仪器有限责任公司；多管旋涡混合器 北京普立泰科仪器有限公司；Milli-Q实验室超纯水制备系统 美国Millipore公司；SK250HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；12管固相萃取装置 美国Supelco公司；5～50 mL瓶口分液器 德国普兰德公司；XW-80A型旋涡混合器 苏州江东精密仪器有限公司；移液器(100～1000 μL、1～5 mL) 大龙兴创实验仪器有限公司；电吹风机。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的制备

有结晶的样品，在密闭的情况下，置于不超过60 ℃的水浴锅中，待样品全部融化后混合均匀，迅速冷却至室温，待称量；无结晶的实验室样品，混合均匀后，备用。

1.3.2 提取与净化

提取：称取2 g(精确到0.01 g)样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水后，置于多管旋涡混合器涡旋溶解，待固相萃取小柱净化。活化：先以25 mL水预洗小柱，流速为1滴/s，待液相距离上层筛板约2 mm处，开始上样；上样：溶解液全部过柱，流速控制在1滴/s，弃掉流出液；淋洗：以25 mL 7%乙醇水溶液进行淋洗，弃去淋洗液；洗脱：用10 mL 50%的乙醇水溶液进行洗脱，流速控制在1滴/s，抽干，收集全部洗脱液，转移至50 mL棕色鸡心瓶中，待浓缩。浓缩：将洗脱液置于65 ℃水浴中减压浓缩至干，加入0.50 mL 30%的乙醇水溶液，摇匀，充分溶解，转移至15 mL离心管中，作为供试品溶液待薄层色谱分析。

1.3.3 对照样品的制备与保存

选取不含糖浆的纯蜂蜜作为阴性对照样品，并添加果葡糖浆，制备含有5%、10%糖浆的蜂蜜作为阳性对照样品，按照1.3.2步骤操作，制备供试品溶液，可以一次制备冷冻保存，多次使用。

1.3.4 薄层层析

薄层展开：用10 μL微量进样针在距离薄层板下端2 cm的位置，同时水平间隔2 cm，按照标记好的点，少量多次地点上6.0 μL的供试品溶液，并点上同样量经过处理的纯蜂蜜和含有5%、10%糖浆的对照品溶液；点样结束后，把薄层板放入展开槽中(薄层展开前，展开槽加入30 mL展开剂，液面高度约为0.5 cm，盖好盖板，蒸汽预饱和15 min)，按倾斜向上法展开，当展开剂前沿到达标记好的爬板终点线时，从展开槽中取出薄层板，晾干或者用吹风机冷风吹干，预计展开时间为150～180 min。显色：把显色剂用喷雾瓶均匀喷雾在薄层板上，等溶剂完全挥发后，放入105 ℃的恒温干燥箱中烘15 min，使之显色。

1.3.5 结果判定

观察显色情况，纯蜂蜜在比移值Rf=0.35以上的区域只有2～3个蓝色中带灰色或咖啡色的斑点，混有糖浆的蜂蜜却是从原点开始呈现出蓝色带状样的斑点群，因此，假如从原点开始到Rf=0.35位置附近有蓝色带状斑点群出现，应考虑蜂蜜样品中混有淀粉转化来的高果糖淀粉糖浆，可以判定为阳性，见图1。点样量为6 μL时，检出限为含有5%的糖浆。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的选择

纯蜂蜜和高果糖淀粉糖浆中绝大部分糖类是单糖，还含有少量的二糖，纯蜂蜜中含有3%～4%的低聚糖，不含高分子糖，而高果糖淀粉糖浆含有微量高分子糖，因此，可根据糖成分的不同，随着糖链的增加，结合薄层色谱，其比移值Rf相应降低，来区分纯蜂蜜和掺有高果糖淀粉糖浆的蜂蜜。在用薄层色谱展开前，需要除去样品中单糖和二糖的干扰，并分离和富集其中的高分子糖。在GB/T 18932.2-2002中，使用2.0 g硅藻土、12.0 g活性炭和硅藻土混合物(1+1)、2.0 g硅藻土，加水，依次自然沉降堆积，制得活性炭玻璃层析柱；上样后，并分别用500 mL水预洗，300 mL乙醇溶液(7+93)淋洗，100 mL乙醇溶液(1+1)洗脱；洗脱液用旋蒸蒸发仪浓缩蒸干后，在真空干燥箱中干燥，干燥完毕后，称取鸡心瓶的质量，计算溶出物的质量，按每10 mg溶出物加0.1 mL水的比例，加水溶解，以备薄层色谱分析用。标准方法在实际操作过程中，活性炭玻璃层析柱因长度较长，填料较多，增加了液体的流动阻力，同时需要溶剂的量较大，所需的实验时间较长，不利于批量操作，增加了检测成本；同时，在层析柱分离和富集的过程中，需要持续保持在负压状态下，少量的填料会通过玻璃棉进入到接收瓶中，影响溶出物质量的准确性。

本研究采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃层析柱，对前处理过程进行了优化，具体步骤见1.3.2，优化的方法减少了硅藻土、活性炭和试剂使用量，溶出物加入0.50 mL水直接溶解的方式，缩短了前处理过程的时间，见表1，并结合固相萃取装置，可以进行批量样品的同时处理，降低了检测成本和提高了检测效率。

表1 不同前处理过程的对比

2.2 薄层色谱展开结果

采用本研究方法与GB/T 18932.2-2002方法分别对纯蜂蜜及添加外源糖浆的阳性对照品进行处理，并在硅胶薄层板上展开，结果见图1。

图1 薄层色谱法测定样品的结果

由图1可知，1号、2号和5号是按照本研究方法进行前处理，其中1号为含10%高果糖浆的蜂蜜，2号为含5%高果糖浆的蜂蜜，5号为纯蜂蜜；3号、4号和6号是按照GB/T 18932.2-2002进行前处理，其中3号为含5%高果糖浆的蜂蜜，4号为含10%高果糖浆的蜂蜜，6号为纯蜂蜜。由图1可以看出1，2，3，4号除了在Rf>0.35处出现了斑点外，在从近原点处开始呈现蓝色带状斑点群，判定结果为阳性，5，6号在Rf>0.35处出现了大斑点，在Rf<0.35位置薄层板比较干净，未出现斑点，判定结果为阴性。比较本方法与标准方法所得谱图，结果显示两种试验结果一致，表明本研究方法可以对蜂蜜中高果糖淀粉糖浆进行定性判断。

2.3 实际样品测定

为了进一步验证本方法的适用性，选取了实验室收集和市场采购的共计45个蜂蜜样品，按照本研究建立的方法进行实验，同时，对这些蜂蜜按照GB 5009.8-2016的方法，测定了果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量，以及按照GB/T 18932.1-2002的方法，测定蜂蜜中碳-4植物糖的百分含量，通过这些指标判断选取的蜂蜜是否有外源性植物糖浆的掺入，蜂蜜样品测定统计结果见表2。

表2 蜂蜜样品测定结果

续 表

由表2可知，在45个蜂蜜样品中共有8个样品掺入了外源性植物糖浆，占总体样品的17.78%。

根据2020年版的中国药典《蜂蜜》和GB 14963-2011《食品安全国家标准 蜂蜜》规定：果糖和葡萄糖的总量不得少于60 g/100 g；蔗糖的含量除桉树蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜、野桂花蜜不得高于10 g/100 g外，其他蜂蜜不得高于5 g/100 g；麦芽糖含量不高于5 g/100 g。由表2可知，除L17号样品外，所有蜂蜜样品的果糖和葡萄糖含量都在规定的60 g/100 g以上，蔗糖和麦芽糖的含量均低于5 g/100 g，L17号样品果糖和葡萄糖的含量为4.9 g/100 g，麦芽糖含量高达42.6 g/100 g，判断该样品添加了外源性糖浆，主要成分为麦芽糖浆。

按照GB/T 18932.1-2002《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法 稳定碳同位素比率法》计算结果规定，当计算结果≥7%时，应认为含有碳-4植物糖。表2中L21、L27、L35、L36、L44号样品的计算结果大于7%，表明这5个样品添加了碳-4植物糖(主要是指玉米糖或甘蔗糖)，L17号样品未提取出蛋白，由于真实蜂蜜样品中含有蛋白，结合糖含量的测定结果，该蜂蜜样品为假蜂蜜样品。

按照本研究建立的方法对选取的蜂蜜样品进行实验，在硅胶薄层板上的展开结果见表2，其中L17、L18、L30、L36号样品在薄层色谱法中呈阳性，表明这些蜂蜜样品中掺有淀粉转化来的高果糖淀粉糖浆。

3 结论与展望

本研究通过对GB/T 18932.2-2002标准方法的样品前处理过程进行了优化，采用固相萃取小柱代替活性炭玻璃层析柱，结合固相萃取装置，可以进行批量样品的同时处理，减少了填料和试剂使用量，缩短了前处理过程的时间，降低了检测成本，提高了检测效率，比较了本方法与标准方法的测定结果，谱图显示两种实验结果一致，表明本研究方法可以对蜂蜜中掺有的高果糖淀粉糖浆进行定性判断，能满足生产企业和检验机构的检测要求。

随着蜂蜜中掺入糖浆来源多样，以及掺假手段越来越复杂，薄层色谱法的应用有一定局限性，且很难通过一种检测方法对蜂蜜的掺假进行确证，需要结合多种检测方法来保证结果的准确性，同时，蜂蜜掺假的检测技术也要随着掺假手段的变化而不断发展。