Let-7a-3p通过靶向AMPK对肺癌细胞系A549能量代谢及凋亡的影响

张晶 舒琦瑾 项宗汉

Let-7a-3p是一种来自Let-7a-1或 Let-7a-3干环左臂的成熟微小RNA（miRNA），且Let-7a作为抑癌基因在癌症中被广泛研究。周恩等［1］研究提示，Let-7a-3p的同源类似物Let-7a能显著抑制Hep-2细胞的增殖，并使细胞凋亡率明显升高。吴源周等［2］研究表明Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549细胞中肿瘤干细胞的活性。但Let-7a-3p对肺癌细胞的能量代谢及机制尚未见报道，因此本研究采用Let-7a-3p模拟物基金项目：浙江省中医药管理局重点项目（2009ZA003）作者单位：311200 浙江省杭州市萧山区中医院（Let-7a-3p mimics）转染人肺癌细胞系A549细胞，观察其对肺癌细胞糖酵解和葡萄糖摄取及凋亡的影响，并通过研究其对肺癌细胞相关功能蛋白及AMPK蛋白表达水平的影响，进一步明确其分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549（购自ATCC）；DMEM高糖培养基和胎牛血清（上海微科生物技术有限公司）；Real-time PCR 逆转录-聚合链酶反应试剂盒（TaKaRa）；CCK-8试剂盒（日本同仁公司）。Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK抗 体（Abcam）；Let-7a-3p mimics及其阴性对照（negative control mimic）、Let-7a-3p 及内参照U6的PCR引物（百奥迈科生物技术有限公司）；转染试剂脂质2000（上海联硕宝为生物科技有限公司）；XF糖酵解压力测试试剂盒、XF细胞线粒体压力测试试剂盒和XF基础培养液均购自美国SeahorseB ioscience公司。

1.2 方法 （1）miRNA转染及各组细胞系中Let-7a-3p水平的RT-qPCR检测：用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）常规培养A549细胞。按照转染试剂的说明书进行，在细胞融合度约为70%时以miRNA mimics终浓度为80 nmol/L转染Let-7a-3p mimics和negative control mimic，分别作为Let-7a-3p组和negative control（NC）组，转染48 h；以未转染的A549细胞作为对照组。根据北京百奥公司的组织细胞miRNA 提取试剂盒说明书进行RNA 提取操作，参照Thermo Scientific反转录说明书，合成cDNA。并以双标准曲线的相对定量法进行qPCR定量分析，以人U6作为内参照，反应条件为：95 ℃ 30 s 1循环；……