男性乙型肝炎病毒感染对冷冻胚胎移植结局的影响

孙成光

(重庆医科大学附属第二医院妇产科 重庆 400010)

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种DNA病毒，可在人群中通过血液或者其他体液传播，引起急性或慢性肝脏损伤。据世界卫生组织统计，全球约有2.57亿人患有慢性乙肝感染[1]。我国是乙型肝炎病毒感染大国，2013年至2017年，我国普通人群HBV感染患病率为6.89%（95%Cl:5.84%-7.95%），据此推断，2018年我国约有8400万人乙型肝炎病毒表面抗体（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性[2]。

HBV主要传播途径有母婴传播、密切生活接触传播、性传播等。当皮肤黏膜受损时，接触到HBV携带者的血液、唾液、精液、阴道分泌物等就会造成病毒的传播感染[3][4]。近年，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）技术应用越来越广泛，我国每年人类辅助生殖技术类别总周期数超100万，出生婴儿数超过30万3，而我国HBV高风险地区育龄期男性HBV感染率为6.35-6.47%4，HBV感染对辅助生殖技术的影响近些年也受到关注。研究发现，男性感染HBV会导致精液质量下降，引起男性不育[5][6][7]。同时，HBV的DNA会整合到胚胎基因组中进行表达，造成胚胎携带有HBV，对胚胎的发育造成潜在的影响[8][9][10]。然而，对于男性感染HBV对冷冻胚胎移植（Frozen embryo transfer，FET）结局的影响国内外研究较少。

在IVF-ET过程中因各种原因无法移植新鲜胚胎而需将胚胎进行冷冻保存，随后择期行FET。目前，冷冻胚胎主要使用玻璃化冷冻技术，胚胎的冷冻、解冻的效率和安全性得到了有效保障。HBV整合到胚胎基因组后会持续表达产生新的蛋白，这些蛋白可能对胚胎着床、发育等造成潜在影响。本文回顾分析男性感染HBV患者FET周期的临床结局及其相关影响。

一、对象与方法

（一）研究对象

在2016年1月至2020年3月于重庆医科大学附属第二医院生殖中心行第一次FET辅助生殖助孕患者中进行筛选。其中男方血清HBsAg阳性，且女方血清HBsAg阴性为HBV感染组，男女双方血清HBsAg均为阴性的为对照组。排除标准为：移植第3天胚胎细胞数小于7或胚胎级别为三级；移植囊胚级别为3BB或4BC以下；女方存在反复着床失败、复发性流产、控制不良的内分泌疾病、宫腔疾病、子宫内膜异位症；男女双方存在丙型肝炎（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染等。

（二）治疗方案

1.胚胎冷冻与解冻

在IVF-ET周期中，培养至卵裂期胚胎或囊胚期胚胎，若没有移植，可考虑将可利用胚胎进行冷冻保存。根据伊斯坦布尔共识[11]卵裂期优质胚胎定义为：细胞数为7-12个，细胞大小与发育阶段相符，无多核现象，碎片率＜10%。囊胚的优质胚胎定义为：囊胚发育阶段至少为3-4期；内细胞团形态规则，直径60μm以上，细胞大小均匀，融合；滋养细胞层沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球数明显超过10个，大小均匀，在囊胚底面的细胞全部形态清晰，大多数可见细胞核。胚胎玻璃化冷冻载体（CRYO BIO SYSTEM-TMV Technologies公司，法国）和玻璃化冷冻试剂（Vitrification Kit，SAGE公司，美国）进行玻璃化冷冻保存。FET周期的胚胎解冻采用解冻试剂盒（Wanning Kit，SAGE公司，美国）进行胚胎解冻。

2.FET

FET周期内膜准备方案分为自然周期和人工周期两种。对于月经规律，既往内膜情况良好的患者可采用自然周期行FET，自然周期于排卵日当日开始口服孕酮（地屈孕酮，abbott公司，荷兰）转换内膜。对于既往月经不规律或内膜情况较差以及有内膜异位、子宫肌瘤等患者，可考虑行人工周期行FET，人工周期一般采用雌孕激素序贯方式建立，转换内膜时间和方式与自然周期相同。卵裂期胚胎一般在内膜转换的第4天移植，囊胚则一般在内膜转换的第5天移植。每个FET周期最多移植2枚胚胎。

（三）随访观察指标

以临床妊娠情况作为主要观察指标，以胚胎移植后28-35天，彩超下可见宫内孕囊、胎心、胚芽为准，临床妊娠率=临床妊娠周期数/总移植周期数*100%。次要指标为胚胎着床率、生化妊娠率和早期流产率。血清人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）≥25IU/L为生化妊娠，生化妊娠率=生化妊娠周期数/总移植周期数*100%。妊娠小于13周流产称为早期流产，早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数*100%。

（四）统计学方法

采用SPSS 26软件进行数据统计分析。定量资料首先采用Shapiro-Wilk检验进行数据正态性检验，若符合正态分布组间比较采用t检验；若不符合正态分布则组间比较采用Mann-Whitney U检验。定性资料采用百分比表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。单因素Logistic回归分析妊娠相关因素，多因素Logistic回归分析各因素相关性。所有检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

（一）HBV感染组与对照组基线资料对比

感染组与对照组共计纳入个770个FET周期，其中HBV感染组108个周期，对照组662个周期。两组患者在年龄（女方）、BIM（女方）、继发不孕比例、不孕原因、IVF周期获卵数、全胚冷冻比例、FET周期内膜准备情况、胚胎解冻存活情况、移植胚胎情况等数据对比，均无统计学差异（P＞0.05）见表1。

表1 两组研究对象的基线特征

注：*采用Fisher确切概率法

（二）FET周期结局

两组患者在临床妊娠率、胚胎种植率等方面差异无统计学意义（P＞0.05），而在活产率及早期流产率方面两组患者差异有统计学意义（P＜0.05）详见表2。

表2 FET妊娠情况

（三）单因素Logistic回归分析

将所有可能对妊娠结局造成影响的参数进行单因素Logistic回归分析，发现各因素与临床妊娠结局Logistic转换存在线性关系，详见表3。从中选择HBV感染、女方年龄、继发不孕、卵巢因素、移植优质胚胎等因素进行多元Logistic回归分析，详见表4。

表4 多元Logistic回归分析结果

表3 单因素Logistic回归分析

三、讨论

本文通过回顾性分析FET周期中男性HBsAg携带的患者与健康对照组之间的临床数据对比分析，探讨男性HBsAg携带对FET周期妊娠结局的影响。研究结果显示，男性HBV感染对于胚胎的解冻存活、胚胎种植、临床妊娠率等无影响，但HBV组在活产率（28.7%vs41.1% P=0.015）和早期流产率（27.9%vs13.1%P=0.010）差异有统计学意义，表明HBV感染会增加早期妊娠的流产率，降低活产率。多元Logistic回归结果显示女方年龄（OR=0.932，95%CI=0.891-0.980，P=0.005）和移植优质胚胎（OR=0.671，95%CI=0.457-0.985，P=0.042）对临床妊娠结局有较大影响，而HBV感染对于临床妊娠率无明显影响。

Hu等[12]对女方、男方或男女双方均为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清反应阳性的夫妇的卵母细胞及胚胎进行通过荧光原位杂交检测发现卵母细胞及胚胎细胞中均发现HBVDNA。同时Ye[13]等在女方HBV携带的胚胎中检测出HBV mRNA,显示HBV存在转录、表达以及产生蛋白质等，这些都可能对胚胎造成影响。叶峰等[14]通过对慢性HBV感染父亲体外受精后遗弃胚胎进行单细胞RT-PCR发现胚胎中检测出HBVmRNA。同时其研究显示，父亲携带有HBV感染的胚胎移植后临床妊娠率无明显差异，检测出有HBVmRNA携带的1例同期移植的新鲜胚胎发生了早期流产。本研究显示，男方有HBV感染FET周期胚胎在解冻移植后胚胎种植率（32.7%vs34.2% P=0.701）、临床妊娠率（39.8%vs48.5% P=0.094）无明显差异，但早期流产率（27.9%vs13.1% P=0.010）升高明显，活产率明显下降（28.7%vs41.1% P=0.015）。

目前大量研究显示女性感染HBV会辅助生殖结局造成影响，如对于男性HBV感染对FET周期临床结局影响的报道非常少，He F等[15]2018年首次报道了FET周期中男性感染HBV对临床妊娠结局的影响。该文章纳入HBV感染周期39个，阴性周期78个，其结果显示HBV感染会降低临床妊娠率、胚胎种植率及活产率，本研究结果与其具有一致性。但其流产率两组比较无明显差异与本研究相左。分析原因如下：均系回归性研究，样本纳入存在一定偏倚；男性感染HBV导致胚胎携带有HBV的感染效率不是很明确；本次研究是在此基础之上进行的数据收集可能会导致结果差异；需要更多的前瞻性研究进行验证。

本研究系回顾性研究，相对存在一些缺陷：样本纳入以本单位收治的病人为来源，缺乏多中心样本；缺乏对FET胚胎的HBVDNA检测数据，后续可考虑从FET培养液进行检测；在样本量扩大的前提下可制定更加严格的纳入标准，如增加卵巢功能评估、促排卵方案的评估、不良生活习惯及心理状态评估等；后续研究可考虑进行前瞻性研究，进一步评价男性HBsAg携带对胚胎冷冻及胚胎发育的影响。