非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲猪瘟病毒CD2v 和MGF 360-505R 基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。

1 主要试剂

1.1 核酸提取试剂盒。

1.2 无核酸酶水。

1.3 荧光PCR预混液（2×）。

1.4 引物和探针：P72、CD2v、MGF360-505R 基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供（联系人：李林，电话：0532-87839188）。

1.5 阳性和阴性对照：阳性对照样品为ASFV 基因组DNA 标准物质（用无核酸酶水稀释1 000 倍后使用），由国家非洲猪瘟参考实验室提供；阴性对照样品为无核酸酶水。

2 主要仪器设备

2.1 荧光PCR扩增仪。

2.2 台式低温高速离心机。

2.3 组织匀浆机。

2.4 微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格）。

2.5 无核酸酶离心管与吸头。

2.6 PCR扩增管。

3 样品采集和运输保存

对活猪，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；对病死猪或已屠宰猪，可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。

样品的运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》相关要求。上述样品可在4 ℃下最长保存2 d；如需长时间保存，应置于-20 ℃以下。

4 样品处理

4.1 组织样品 取0.1～0.2 g样品，加入1～2 mL预冷的PBS（pH 7.4），用组织匀浆机高速匀浆，制成10%组织匀浆液，以5 000 r/min 离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。

4.2 液体样品 抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理，直接取200 μL进行核酸提取。

5 病毒核酸的提取和纯化

取已进行前处理的样品200 μL，可按传统方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20 ℃以下冷冻保存。每次抽提核酸，应包括一个阳性对照样品和一个阴性对照样品。……