葡萄种子休眠研究进展

李上云 王晨 宣旭娴 任艳华 房经贵

（南京农业大学园艺学院，南京 210095）

葡萄是世界上重要的栽培果树之一［1-2］。葡萄栽培品种随市场需求不断变化，市场对葡萄品种多样化的要求日渐增强，因而品种选育成为葡萄研究的一项极为重要的工作。杂交育种一直以来是葡萄育种的主要途径，但杂交种子的萌发率低却是影响杂交育种效率的关键因素。研究表明，休眠是种子萌发所需条件的一个关键因子［3-4］，但往往因休眠特性复杂、萌发率低，导致种子成苗效率低下，严重影响新品种选育效率。葡萄作为世界上最古老的果树树种之一，因其分布范围广，生长环境变化大，种子形成了明显的休眠特性［5］，即在一定时间内，具有生活力的种子在适宜的环境条件下不能完成萌发。对于葡萄育种而言，一方面，若种子休眠期短、萌芽整齐一致、发芽迅速、成苗快和成苗效率高，则育种效率高；另一方面，若休眠时间较长且不同种群差异大和种子萌发率低，特别是杂交后代种子成苗质量差，则会成为制约葡萄育种效率提高的严重问题［6-7］。

近年来，对葡萄种子休眠及其调控的研究已取得了一定的进展［8-9］，多集中于葡萄种子类型、休眠形成机制、休眠调控和促进萌发等方面，但各研究之间的关联度较差，知识点较为分散，休眠机制尚不明晰，未能形成合理的理论体系。目前，因为葡萄不同群体间休眠差异较大，后代种子所体现的休眠程度不一，调控机制无系统报道，加之种子萌发率低，导致成苗质量差，技术体系也难以形成，严重影响了葡萄育种效率。为促进种子休眠及萌发研究的发展，本文对上述研究内容进行梳理综述，以期形成葡萄种子休眠的系统架构，为深入研究休眠机制和解决种子休眠与萌发的问题提供理论依据，同时也为种子休眠与萌发机制的研究指明方向。

1 休眠类型

种子休眠形成不仅受自身遗传物质的控制，也受发育过程中环境的影响。休眠类型研究一般从“空间”和“时间”两方面出发［6］。“空间”上将种子休眠分为种壳休眠（物理休眠、化学休眠和机械休眠）、胚休眠（形态休眠和生理休眠）和复合型休眠；“时间上”将种子休眠分为先天性休眠、二次休眠和无休眠；基于Nikolaeva［10］提出的生理学休眠类型，Baskin等［11］把种子休眠分为5类（即5类休眠法）：生理休眠、形态休眠、形态生理休眠、物理休眠和复合休眠，后者在生态学上使用较为广泛。在Baskin［11］提出的休眠归类理论的基础上，Linkies等［12］研究认为，大多数核心真双子叶植物基本属于生理休眠。在葡萄胚休眠过程中，诱导种子胚休眠的不是胚自身，而是胚外围组织或器官（果肉、种皮和胚乳等）；甘阳英等［9］对不同种源的葡萄种子休眠及萌发特性研究中得到葡萄种子休眠属于生理休眠，确定种子休眠是由胚外围组织导致，且不同种群休眠程度不一（休眠程度：东亚种＜欧亚种＜欧美杂交种＜美洲种），由此可明确葡萄种子休眠类型（图1），为调控葡萄种子休眠解除和萌发提供理论依据。

图1 种子（葡萄种子）休眠归类Fig.1 Dormancy classification of seeds (grape seeds)

2 休眠机制假说

葡萄种子的休眠机制一直是葡萄研究的一个重要方向，因其形成较为复杂，尽管已在分子生物学方面有了较深入的研究，但到目前为止，也未能解释其核心问题。有学者指出，种子能否萌发成苗，是胚的生长冲力与种壳或其他外围组织的阻力此消彼长的结果［6，13］。因此，葡萄种子休眠机制的研究中，本质是探究如何提高胚生长冲力或降低外围组织阻力，推断二者何为种子成苗的主因。围绕这一核心，国内外众多学者主要将种子休眠机制的假说分为2大类，即形成激素理论和氧化理论（图2）。

2.1 激素理论

图2 种子休眠形成机制Fig.2 Formation mechanism of seed dormancy

1964年ABA从植物体中被分离出来，后有研究者发现其就是致使种子休眠的内含发芽抑制物［6］。Amen［14］考虑到赤霉素（gibberellin，GA）具有促进发芽的作用，于1968年提出激素平衡理论，认为GA诱导产生各种水解酶的作用会被具有抑制能力的激素消解，从而抑制种子发芽，使其表现出休眠状态；当GA作用强于抑制物时，种子可正常发芽。

1975年，基于前述理论，Khan［15］认为种子内各种激素分工平衡，提出新平衡理论，但未能解释为何外源添加GA与细胞分裂素（cytokinin，CTK），仍有大部分种子无法发芽的问题。随着分子生物学的发展，植物突变体的出现，使激素理论取得较大进步。Karssen等［16］学者根据一系列研究，提出种子休眠的激素分工理论（遥控理论），其表明种子休眠与脱落酸 （abscisic acid，ABA）有关，GA与种子能否发芽相关联；虽然该理论一定程度上丰富的激素平衡理论，但是仍未能解决休眠性如何维持的问题。基于此理论，研究人员利用突变体进一步开展了种子休眠基因的调控研究［17-18］。研究发现种子休眠的解除可能与ABA与GA的互作有关。Bill［19］研究发现，ABA可以调控GA的代谢及其信号传导，反之亦可。Linkies等［12］认为种子的休眠可能与乙稀、茉莉酸盐等激素有关。另外，近年来大多数研究表明：通过外界条件（光、温度和水分等）调控GA、ABA相关基因，以此调节种子休眠。虽然，GA促进种子发芽的具体机制仍不清晰，但ABA等激素具有抑制葡萄种子发芽、促进休眠的作用已明确［20-24］。这一结论进一步辅证了激素理论，为激素调控葡萄种子休眠提供了理论依据。

2.2 氧化理论

Roberts［25］通过一系列稻粒发芽的研究指出，种壳是导致休眠的重要因素，通过排除法推理得出稻壳阻碍种子吸收氧气，而氧气对种子发芽的影响较大，同时提出若糖酵解作用（TCA循环）在氧气充足的前提下，N3-、CN-等呼吸抑制剂处理种子，理论上可延迟种子发芽。尽管如此，但该推论仍无法解释某些现象，因此通过大量研究之后，1969年Roberts［26］第一次提出戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway，PPP）假说，认为种子发芽与否，取决于PP途径运行状况，并解释了氧气与促进休眠种子发芽的关系。该假说明确了种子发芽初期细胞的需求与PP途径的相关性，且两种途径都存在于一般生物系统之中，C6/C1在0-1之间。PPP假说虽指出PP途径是种子发芽的前提条件，但对于PP途径为何无法在休眠种子中进行尚未有明确的解释。

基于Roberts［27］提出得呼吸抑制剂或硝酸根调控种子休眠的论断研究，另一些研究者［28-29］得出的发现休眠种子一般呼吸作用较强，吸收氧的能力强于PP途径。郭华仁等［6］研究发现，呼吸抑制剂可促进发芽是由于此类药剂破坏了种壳的氧化酶活性，使氧气易于被种子吸收。近年来，一些新的相关研究指出，活性氧化物（H2O2、HCLO和HO等）作为氧代谢产物，在信息传递及体内平衡上至关重要，且可能通过激素对后熟种子休眠或发芽进行调控。Nambara［30］研究也发现，种子中氧含量的多少，影响种子发芽抑制物（ABA）含量，从而影响种子休眠与发芽。

种子休眠性很大程度表现在胚、胚乳及种壳上，其形成受遗传所控制。近年来，从分子生物学角度研究休眠，成效较佳［28，30-33］，一般分为成熟调节、激素调节、休眠解除和表现遗传等（图3）。在水稻等作物上发现PYR/PYL/RCAR基因与ABA受体相关，ABA敏感度与ABI1与ABI2关联［34］。另有研究表明，脱氧酶NCED基因是大多数植物的ABA合成所需的，若发生突变，ABA则无法合成，后熟种子休眠性降低。

众多研究表明，葡萄种子作为后熟种子，其休眠机制基本符合激素理论和氧化理论，二者虽尚未完全解释葡萄种子休眠机制，但二者之间相互联系，为阐明种子代谢作用以及种子休眠机制提供了重要理论依据，同时也为解除葡萄种子休眠提供了重要参考。

图3 种子休眠部分相关基因（拟南芥、水稻）Fig.3 Some genes related to seed dormancy (Arabidopsis thaliana and rice)

3 休眠与萌发的调控

种子休眠是植物长期演化获得的环境适应性，休眠特性与其地理起源和分布地的环境条件有关［36-37］。葡萄种子的休眠与萌发调控主要依据激素理论和氧化理论，围绕如何降低种子内生长抑制剂含量与增加种子内生长物质含量和减少种壳（外围组织）阻力与提高胚内氧气含量等问题进行探究。为找到快速解除葡萄种子休眠和提高种子萌发的方法，前人开展了大量研究，尽管取得了一定进展，但尚未开展系统综述，且未找到高效调控的技术。为此，基于前人研究，并对其进行系统地归纳总结，绘制出种子休眠机制形成基本调控图（图4），以期为研究葡萄种子高效破眠与萌发技术提供经验和理论参考。

3.1 物理调控

3.1.1 温度与层积处理 通过调控温度，将种子层积处理，是打破种子休眠的主要方法。按温度范围及变化，可以分为低温层积（冷层积）、常温层积（暖层积）、变温层积。甘阳英等［9］为探究葡萄种子休眠与解除的规律，利用3个不同分布中心的种群及其杂交种的20个品种，研究冷层积、常温层积、变温层积等方法打破葡萄种子休眠的效果，发现暖层积打破葡萄休眠种子效果不佳，冷层积（4-5℃）和变温层积［即20℃（14 h）/10℃（10 h）和30℃（14 h）/20℃（10 h）］2个月可以有效打破欧亚种、东亚种及其杂交种（欧山杂种）的休眠；但对于打破美洲种及欧美种的休眠，变温层积和暖层积皆无效果，冷层积时间延长至5个月及以上可打破休眠，因此，打破葡萄种子休眠的研究主要集中在用冷层积方面。

通过模拟自然条件打破种子休眠的研究发现，低温层积法可以软化种皮、增强透性、降低脂类物质等抑制剂的含量、增加赤霉素的含量等，从而可以达到诱导休眠种子萌发的目的［31］。崛内昭作作等［37］研究发现，胚的休眠与果实成熟期相关，对于完熟的葡萄种子，5℃层积3个月可以打破休眠；于桉［38］利用不同方法处理山葡萄种子，冷层积处理4个月，发芽率可达61.4%，高于其他处理；甘阳英等［5］研究总结出葡萄属不同种群种子休眠程度深浅的规律，即：欧山杂种＜欧亚种＜欧美杂种＜美洲种，且杂种的休眠程度浅于其亲本；林玲、李伟东和Heo等［39-41］发现，冷层积对打破不同倍性葡萄种子的休眠效果存在差异，四倍体葡萄萌发率低于二倍体葡萄；罗尧幸等［42］得出冷层积4个月后，不同品种葡萄种子萌发率不同，“北冰红”萌发率（89.5%）最高，“赤霞珠”（50.0%）最低。

图4 葡萄种子休眠与萌发基本调控Fig.4 Basic regulation of grape seed dormancy and germination

上述研究表明，低温层积处理可在一定程度上打破葡萄种子休眠，但对打破不同倍性及不同种群的葡萄种子的休眠程度存在差异。因此，研究层积处理与打破不同种群葡萄种子的休眠之间的关系，对葡萄杂交种子休眠解除与萌发具有重要意义。

3.1.2 机械处理 葡萄种子休眠是由于胚休眠导致，种壳及其外围组织致使其透性不良是引起休眠的其中一个原因，因此可通过机械的方法打破外围组织的束缚，增加氧气及提高透性，以促进发芽和解除休眠。甘阳英等［9］，以不去种皮为对照，用除去种胚端的种皮（不损伤胚乳）；除去种胚端的种皮和胚乳；剥取完整胚等处理，探究葡萄种皮和胚乳对萌发的作用发现，欧美杂种“京亚”除外，去除种胚端的种皮、种皮和胚乳后（胚珠完整），离体种胚的萌发率显著增加。这些研究表明机械处理有助于促进葡萄种子萌发，这为提高葡萄杂交种子萌发率提供了理论依据。

3.2 化学调控

3.2.1 激素处理 大多研究表明，乙烯、细胞分裂素（CK）、赤霉素（GA3）、萘乙酸和乙烯利等植物生长调节剂能打破某些种子的生理休眠。如卓小能等［21］研究发现，利等植物生长调节剂能打ABA含量较高，用40%石灰氮浸提液浸泡18 h，可打破其休眠；刘会宁等［21］证明了生长调节剂在一定程度上能够促进种子发芽，但不同药剂处理对同一品种发芽效果存在差异，同一药剂处理对不同品种发芽效果也存在差异。潘学军等［43］在外源激素处理对贵州毛葡萄种子发芽的影响研究中指出，GA、6-BA对毛葡萄种子活力都有显著的提高，但 GA处理的发芽整齐、幼苗质量高、整体效果好。而Huseyin等［44］在研究打破葡萄种子休眠过程中发现，1 500 ppm的GA3处理后，种子萌发率可达51.72%。而潘学军等研究发现，一定浓度的GA3可显著提高种子萌发效率，且不同品种所需浓度不同定浓度。张艳和王庆莲等［45-46］对GA3打破欧亚种葡萄种子休眠的研究中发现，葡萄种子在2 000-2 500 mg/L的GA3溶液中浸泡24 h，萌发率约60%。因此，尽管激素处理葡萄种子能在一定程度上打破休眠和提高散发率，但不同激素在不同种群葡萄种子休眠打破方面的作用不尽相同。

3.2.2 无机化学药剂处理 研究发现，浓硫酸、高锰酸钾、次氯酸钠和过氧化物等无机化学药剂对打破由外围组织束缚而引起的种子休眠有一定的作用。甘阳英等［9］通过浓硫酸处理葡萄种子休眠发现：浓硫酸可打破部分种子休眠，且能提高萌发率，但不同品种所需的浓度及时间不同，浓度和处理时间不当会毒害种子，在一定程度上体现出，无机化学药剂对打破葡萄种子休眠的具有局限性。

3.3 基因调控

目前，学者们已鉴定了大量编码休眠调控蛋白的基因［47］（图3），主要分为调节休眠诱导和维持以及与休眠释放有关的蛋白，其中DELLA等蛋白与休眠释放和调节GA生物合成有关，且可以调控种子萌发及休眠［29，31］。据研究报道［48-50］，GA 受体GID1、DELLA蛋白、F-box蛋白和DELLA调控的靶因子构成核心GA信号转导途径，GA与GID1的结合促进GID1与DELLA抑制因子相互作用，从而通过泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin proteasome pathway）引起DELLA的降解和GA响应［51-52］，抑制种子休眠形成；DELLA基因突变（RGA-LIKE2、SPINDLY，即RGL2、SPY），可影响GA生物合成基因，如拟南芥种子的AtSdr4L突变体atsdr4l，引发GA生物合成降低［53-55］，抑制萌发；GA处理或加强GA信号，一方面可上调GA3ox1和GA20ox1的表达及下调GA2ox1的表达［56-59］，增强GA的合成与信号（ABA的分解代谢），促使种子由休眠状态向萌发转变；反之， 使 GA3ox1、GA20ox1、GA20ox2和 GA20ox3的转录水平下调；另一方面上调GA2ox1和GA2ox2（GA分解代谢基因）的转录水平，一定水平上促ABA信号（ABRES）传递，促进种子休眠。

ABI3、ABI4是ABA信号传导的主要组分［46］，ABI3是下游组分，其表达受DEP（DESPIERTO）调节，参与种子发育调控，dep种子表现为完全休眠；种子成熟与萌发过程中，ABI3转录可被WRKY41直接控制，以此调节拟南芥种子的休眠；MYB96通过介导ABI4（种子休眠的正调节因子）和ABA 生物合成基因（NCED2 和NCED6）的表达，调节种子休眠与萌发；ABI4 可正调节ABA 的分解代谢基因和负调节GA的生物合成基因，促进种子休眠并抑制萌发；ABI5负调节种子萌发；CHO1即CHOTTO1（AP2结构域的转录因子）和SPT是种子休眠中的重要因子，与ABI4关联度大，SPT-ABI4模块对种子休眠的建立和维持起着关键性作用，AP2 的转录因子在ABI4的上游起作用，负向调节GA 生物合成，同时正调节ABA 生物合成，促使种子休眠。除此之外，ABA可影响组蛋白乙酰转移酶HvGNAT/MYST、蛋白甲基转移酶基因KYP/SUVH4等，参与休眠释放。虽然进展相对较慢，但激素合成相关基因的挖掘，一定程度上揭示了激素调控休眠的机理（图5），从分子生物学角度为激素调控葡萄种子休眠与萌发提供了理论依据。

3.4 混合调控

植物种子的生理休眠基本上都是由胚和种壳双重原因引起的，往往采用混合手段对其破眠。在葡萄种子的破眠上，Huseyin等［44］利用GA3+层积的组合研究发现，葡萄种子先用1 500 ppm的GA3处理，再层积35 d，种子萌发率可达53.21%。Uzun等［60］分别用1 000 ppm的GA3、1 000 ppm的BAP、1 mol/L的H2O2和水浸泡24 h后，5℃层积4个月，结果表明GA3处理结合层积处理，葡萄种子萌发率提高到78.32%。除葡萄种子破眠上应用混合手段外，其他种子也有应用，如对石刁柏种子萌发研究中，牛晓雪等［61］采用不同激素和化学试剂处理混合处理种子，结果表明10 mg/L IAA＋0.5% FeSO4组合能显著提高种子萌发率至95%，提高发芽高峰至34%，有效缩短发芽时间，提高成苗效率，一定程度上为混合手段促进葡萄种子高效成苗提供了可行性依据。

图5 基因调控种子休眠与萌发的网络Fig.5 Gene-regulated network for seed dormancy and germination

4 总结与展望

尽管葡萄种子休眠相关的研究取得了一定进展，但仍存在较多问题，需要结合现代先进技术进一步探究其休眠与调控机制。具体研究方向如下：（1）葡萄种子休眠与萌发是两个不同的过程，即独立又相互联系，种子完熟后，只有先打破休眠才能萌发，但休眠和萌发又没有明确的界限及标志；（2）与葡萄芽子休眠相比，葡萄种子休眠机制尚未明晰，且鲜有关于葡萄种子休眠在基因组学方面的研究，葡萄休眠相关的基因和蛋白质组急需挖掘；（3）激素调控方面，虽掌握了ABA与GA和乙烯的关系（ABA诱导休眠，GA和乙烯释放休眠并拮抗ABA 的作用），但尚未明确激素调控技术的核心；（4）休眠与萌发调控方面，目前仍以冷层积、赤霉素等单一技术为主，综合技术研究较少。

上述问题的研究与解决对于打破葡萄种子休眠、促进种子萌发高效技术的研究具有重要意义，同时也为解决葡萄杂交种子萌发率低的问题指明研究方向，一定程度上促进葡萄育种的进程，也为其提供理论依据与实践参考。