鸡毒支原体与鸡安卡拉病毒混合感染病例的实验室诊断

李 梅，杨 鹏，岳 筠，宋 春，成虹松，陈 静 ，尹德晶，张双翔*，程振涛*，李凤龙

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；3. 遵义市红花岗区海龙镇农业服务中心，贵州 遵义 563000)

2020年10月，贵州省铜仁市某蛋鸡场鸡群出现零星死亡，几天后死亡数量急剧增加，在7天内死亡1 000余只，死亡率达21%。经调查，该场发病蛋鸡主要为11月龄；剖检病死鸡可见心包内充满淡黄色液体，肝脏充血肿大，喉头出血。为了查明病因，特进行实验室病原学检测诊断，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集该场3只病死鸡的心脏、肝脏、脾脏、气管、脑组织作为检测病料。

1.2 主要试剂新城疫病毒(NDV)实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、禽流感病毒(AIV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)；2×TaqPCR MasterMix(购自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；鲜血琼脂培养基(自制)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器实时荧光定量PCR仪(bio-rad CFX connect，购自美国bio-rad公司)、多功能梯度PCR仪(VeritiTM96-Well Thermal Cycler，购自ABI公司)。

1.4 细菌分离培养无菌条件下取采集的肝脏、心脏、脾脏组织样品(鲜样)，分别划线接种鲜血琼脂培养基，37 ℃培养24 h后观察结果。

1.5 组织样品DNA/RNA提取分别取3只鸡的心脏、肝脏、脾脏、气管、脑组织病料各1 g于灭菌研钵中，加入生理盐水1.5 mL快速研磨，匀浆后转入1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA试剂盒按说明书方法于室温环境提取总DNA/RNA。

1.6 相关病原核酸检测

1.6.1 NDV核酸检测以提取的总RNA为模板，构建 qRT-PCR反应体系20 μL：无菌无核酸酶水2.6 μL，qRT-PCR反应液10 μL，酶混合液0.4 μL，荧光探针2.0 μL，模板RNA 5 μL。……