绵羊ICSI胚胎培养液中发情绵羊血清浓度优化研究

黄飞，赵建清，陶维昆，刘波，朱文靓，方翟，高庆华,3*

（1塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（3塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

胞浆内单精子注射技术（ICSI）是一项较为尖端的人工辅助生殖技术，该技术能够不经过正常的受精生理过程，而是借助显微操作仪器，直接将处理过的单个精子利用显微注射针注入到成熟的卵母细胞内，使精卵结合并完成受精过程[1]。ICSI技术对研究动物受精机理、保护濒危物种、辅助畜牧生产和治疗人类生殖疾病等方面有着重要作用，同时还能提高转基因动物的生产效率，使该技术无论是对科学研究还是生产实践都具有十分重要的意义[2]。目前，在体外生产ICSI胚胎的过程中，ICSI胚胎培养液替代了绵羊的体内环境，且ICSI胚胎培养液的优劣能够直接影响到培养效果及后期胚胎的发育潜能，因此ICSI胚胎培养液对体外生产胚胎起着决定性因素。因为培养液中含有血清、激素、细胞因子与能量物质等[3]，能为胚胎发育提供所需要的营养成分，这些重要的营养成分，对早期胚胎的存活和发育起着重要作用[4]。在培养液的配制中，血清是常见的重要组成成分，血清中含有激素、微量元素、生长因子和重金属离子等[5]，不仅能提供营养物质，还能维持细胞的稳定性和完整性[6]。常用的血清有胎牛血清（fetal bo‐vine serum，FBS）、发情绵羊血清（ESS）和发情牛血清（estrus bovine serum，EBS）[7]。在绵羊胚胎体外培养液中，添加发情绵羊血清（ESS）要优于添加牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FBS及发情山羊血清（estrous goat serum，EGS）的培养效果[3,8-9]，也有研究发现添加发情3 d羊血清对绵羊卵裂率和囊胚率有明显提高[10]。绵羊血清所含的激素、微量元素、生长因子和重金属离子等更有利于绵羊ICSI胚胎的后期发育[11]。有研究者认为在绵羊卵母细胞成熟培养中，ESS的添加量在5%～20%，并且较低浓度的ESS能有效提高桑椹胚率、囊胚率[12]。而目前在ICSI胚胎培养液中添加不同浓度ESS的研究较少，且ESS的最适添加浓度还没有在绵羊胚胎体外培养体系中得到统一。本试验通过研究在ICSI胚胎培养液中添加不同浓度的ESS对绵羊ICSI胚胎发育的影响，以确定最适ICSI胚胎后期发育的ESS浓度，对体外生产优质绵羊ICSI胚胎体系的建立有着重要意义，并为后期的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

发情绵羊血清（ESS）和精液均采自塔里木大学动物实验站饲养的多浪羊，昆仑一号精液稀释液购自塔克蓝公司，肝素钠购自索莱宝公司，双抗（penicillin-sreptomycin,PS）、TCM-199培养液购自Giboc公司，其余药品均购自Sigma公司。

1.1.2 试剂配制

采卵液：TCM-199培养液+5 mmol/L NaHCO3+20 mmol/L HEPES+10 μg/mL肝素钠+2% PS。

显微操作基础液（MM）：TCM-199培养液+6 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L HEPES。

胚胎基础培养液（IVC）：SOF液+1% NEAA+2% EAA+0.1%肌醇+0.1 μg/mL柠檬酸

钠+0.1%谷氨酰胺+6 μg/mL BSA+0.25 mmol/L葡萄糖+1% PS。

胚胎基础培养液中分别添加A组0%、B组5%、C组10%、D组15%、E组20% ESS配制成含有不同浓度ESS的胚胎发育液。

1.1.3 主要仪器

显微操作仪（型号：NT88-V3）、拉针仪（型号：PN-30）、显微煅烧器，（型号：MF-900）、显微研磨器（型号：EG-400），日本Narishige公司；超净工作台（SWCJ-2FD），博讯公司；CO2培养箱（型号：MC0-15A），日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 发情绵羊血清的制备

发情绵羊颈静脉采血，将血样置于4℃2 h后，以2 500 r/min转速离心20 min后取出发情绵羊血清。将分离好的发情绵羊血清在56℃灭活30 min后过滤分装。

1.2.2 绵羊精液采集

绵羊精液采集是利用假阴道法采集，将新鲜精液按照1∶4的比例与昆仑一号精液稀释液混合。取50 μl检测精子活力，然后置于冰箱冷藏，在2 h内使温度降到0～4℃，待用。

1.2.3 显微操作针的制作

胞浆内单精子注射所用到的显微操作针分为固定针与注射针。本试验胞浆内单精子注射所用到的显微注射针与固定针是由硅酸盐玻璃管在拉针仪、显微煅烧器、显微研磨器下按所需规格自制完成的。显微注射针的制作如图1A、图1B所示，显微固定针的制作如图1C所示。

图1 显微操作针的制作

1.2.4 绵羊卵巢采集

绵羊卵巢采自阿克苏市屠宰场，屠宰后立即取下卵巢，放入37℃加PS的生理盐水中，4 h内运回实验室。

1.2.5 卵丘-卵母细胞复合体的采集与筛选

带回实验室的绵羊卵巢，先用75%乙醇冲洗3遍，再用生理盐水充分清洗3遍，用切割法收集卵母细胞，整个过程始终使卵巢温度保持在37℃。沉淀数分钟后，在体式显微镜下捡出A、B级卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex，COCs），进行培养。

1.2.6 COCs的培养

在CO2培养箱中用微滴法培养筛选出的COCs，培养24 h后转移到0.1%透明质酸酶中，用移液枪反复吹打至脱去颗粒细胞，在体视镜下观察卵母细胞第一极体排出情况并记录。根据公式：卵母细胞成熟率=（成熟COCs总数/COCs总数）×100%，计算卵母细胞成熟率。

1.2.7 胞浆内单精子注射并激活处理

在培养皿中做两个微滴，A滴（添加PVP的MM液）在培养皿中轴上方，A滴中放置精子，B滴（含细胞松弛素B的MM液）在培养皿中轴下方，B滴中放置成熟的卵母细胞。ICSI操作时，在A滴中选择直线运动的精子，用注射针在精子尾部中段猛然划过，使其丧失游动能力，随后将该精子从尾部吸入并移到B滴中。固定针固定卵母细胞时使第一极体位于“12”的方位，注射针由“3”点的位置刺破卵母细胞质膜，再将单个精子注入卵胞浆内，慢慢撤出注射针。注射结束后，将卵子在IVC液中洗2遍，放入CO2培养箱中培养30 min，然后用7%乙醇激活5 min，最后取出放入IVC液中培养。

1.2.8 胚胎体外培养

激活后的卵母细胞分组放入预先平衡的70 μL胚胎发育液微滴中，胚胎发育液分为A、B、C、D、E，5组胚胎发育液分别在CO2恒温培养箱中进行胚胎培养。24 h后记录卵裂卵母细胞数，培养144 h后，统计桑椹胚的数量，根据公式：桑椹胚率=（桑椹胚总数/成熟COCs）×100%，计算桑椹胚率。

1.2.9 统计分析

试验组重复三次，数据采用SPSS 17.0统计软件的单因素方差分析进行显著性检验，LSD多重比较差异，结果用“平均值±标准差”表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

本试验通过培养绵羊卵母细胞发育到桑椹胚，统计桑椹胚发育情况，结果见图2，C组（10% ESS添加组）桑椹胚率显著高于A、B、D、E组（P＜0.05），B、D组显著高于A、E组（P＜0.05），但A组与E组、B组与D组间均无显著差异（P＞0.05）。扩散疏松的COCs如图3D所示，胞浆内单精子注射如图3E所示，桑椹胚如图3F所示。

图2 不同浓度发情绵羊血清对桑椹胚率的影响

图3 绵羊ICSI试验图

3 讨论

本试验是利用胞浆内单精子注射技术得到的ICSI胚胎，然后在ICSI胚胎培养液中添加不同浓度的ESS，进行ICSI胚胎体外培养。从本试验结果可以看出，在绵羊ICSI胚胎的体外培养液中添加10%的ESS，胚胎的桑椹胚率为23.78%，显著高于ESS添加量为0%、5%、15%、20%的分组，表明在胚胎培养液中添加10%的ESS对绵羊胚胎的体外培养有促进作用。

目前血清添加在胚胎培养液中有相关研究，但尚未见过在ICSI胚胎培养液中添加的报道。刘凤军等[13]认为在胚胎培养液中添加血清能影响早期胚胎的发育。刘赛等[14]在研究培养液中血清对牛胚胎体外发育的影响时发现，添加血清组的牛胚胎囊胚发育率显著高于无血清组的，说明血清对胚胎的发育具有促进作用。本试验在ICSI胚胎培养液中添加ESS，桑椹胚率有所提高，说明血清确实能够影响胚胎的发育。GUTIERREZ A等[15]认为在胚胎培养液中加入血清，能够改善胚胎后期的发育情况，引导囊胚的形成，而 PINYOPUMMINTR T等[16]认为在胚胎培养液中加入血清，抑制了胚胎分裂，本试验结果表明添加10%血清能够有效改善胚胎后期发育情况，而高浓度或低浓度的添加量都没有明显的促进作用，反而高浓度会产生一定的抑制作用，与GUTIERREZ A等[15]结果相同。产生这一结果的原因可能是血清含有胚胎生长所需的多种氨基酸、维生素、激素、生长因子和抗氧化物质等[17]，这些物质的对促进胚胎生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。刘凤军等[18]在不同培养液中添加不同浓度山羊血清的研究中发现，在不同的三种培养液中添加10%的山羊血清，囊胚的发育率都是最优的。刘凤军等人的研究结果与本试验结果相同，在胚胎培养液中添加10%的ESS，能有效提高胚胎的桑椹胚率。所以血清添加剂量很重要，添加较少，促进作用不明显，反之，又会抑制后期胚胎分裂效果。

胞浆内单精子注射后的绵羊胚胎在体外培养时，ICSI胚胎一直处在培养液中，所以ICSI胚胎培养液的成分尤为重要。而张宏等[19]在不同培养液及血清浓度对绵羊胚胎体外发育的研究中得出，在培养液中添加10%的FBS可达到良好的培养效果，卵裂率为29.6%，囊胚率为11.3%。虽然本试验是采用单精子注射技术得到的ICSI胚胎，但所得结果与张宏等[19]试验结果基本一致，都能使胚胎达到良好的培养效果，产生这一结果可能是10%的ESS中起到促进胚胎生长的物质与抑制的物质达到一个平衡，使促进作用达到最大化。说明在ICSI胚胎培养液中添加10%的ESS有利于绵羊胚胎的后期发育。而在10%左右是否还有更适的浓度，需要后期进一步试验进行证明。本试验结果对体外生产优质绵羊ICSI胚胎体系的建立有着重要意义，并为后期的注射失活精子使其发育及转基因研究奠定一定基础。

4 结论

利用胞浆内单精子注射技术得到的ICSI胚胎在后续培养时，ICSI胚胎培养液中添加10%的ESS，培养至桑椹胚时的桑椹胚率为23.78%，显著优于其他组。由本试验可得出，在ICSI胚胎培养液中添加10%的ESS能够有效提高绵羊ICSI胚胎的桑椹胚率。