miR-103a-3p过表达靶向负调控PDK4抑制胶质瘤生长及侵袭

郭 放 万学锋 刘献志 杨 强 李太平

胶质瘤是神经系统最常见的原发性肿瘤，具有高复发性、高致残性、高病死率的特点，严重危害人类健康[1]。目前，脑胶质瘤的发病机制尚未完全阐明，但遗传易感、环境污染与其发病关系密切[2]。miR-103a-3p参与卵巢癌的迁移和侵袭过程[3]。丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是线粒体呼吸作用向细胞质糖酵解代谢转换的关键酶，其过表达促进乳腺癌细胞增殖、侵袭及耐药性[4]。利用miRNA靶基因预测数据库对miR-103a-3p的靶基因进行预测发现，PDK4可能是其潜在的靶基因。本文探讨过表达miR-103a-3p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养、转染及分组 将鼠源性C6胶质瘤细胞（美国模式培养物集存库）培养于含10%胎牛血清的完全RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）至对数生长期，0.25%胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）消化制成单细胞悬液。参照试剂盒操作说明采用Lipofectamine®2000（美国Thermo Fisher公司）将质粒miR-103a-3p mimics（上海吉凯基因技术有限公司）、mimics-NC（上海吉凯基因技术有限公司）、pcDNA-NC（美国Invitrogen公司）、pcDNA-PDK4（美国Invitrogen公司）分别转染鼠源性C6胶质瘤细胞，继续培养48 h后，荧光显微镜下观察。若发出绿色荧光信号，则视为转染阳性，测序验证稳定表达后收集细胞用于后续实验。根据转染质粒分为miR-NC组、mimics组、pcDNA组、PDK4组、mimics+PDK4组、control组（未转染质粒）。

1.2 RT-PCR检测miR-103a-3p及PDK4、Ki-67、PCNA mRNA表达 采用TRIzol试剂盒（美国Thermo Fisher公司）提取总RNA，紫外分光光度计测定浓度，并用凝胶电泳检测RNA完整性。按照反转录试剂盒（美国Thermo Fisher公司）说明书合成cDNA，反转录体系（20μl）：2×miRNA反应混合液10μl，0.1%BSA 2μl，miRNA PrimeScript®RT酶混合物2μl，总RNA 1μl，RNase Free ddH2O补充至20μl。反应条件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、30 min。根据荧光定量……