一例以色列急性蜜蜂麻痹病的诊断报告

梁 爽，孙 莉，李 明，费东亮，马跃宇，马鸣潇

（锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

以色列蜜蜂麻痹病（Israeli Acute Paralysis Disease，IAPD），该病为蜜蜂的一种急性传染病，对我国蜜蜂养殖业一直以来造成了巨大的经济财产损失。有研究调查表明，在我国IAPV的发病率占成蜂疾病的66.8%，美国在2007~2009年期间发生了严重的蜜蜂病害，不仅给蜂群造成巨大损失，也严重影响了生态平衡。

1 临床症状

2020年6 月，我国辽宁省凌海市某蜜蜂殖户发生大量蜜蜂死亡，主要表现为蜜蜂体色变暗，动作迟缓，身体抽搐颤抖，行动能力丧失，无法飞行。蜜蜂翅膀和足伸开，腹部膨大。有的身体发育缓慢、瘦小，被健康的蜂群逐出巢门，成年蜂的采蜜能力降低。

2 诊断

2.1 病原的分离、纯化选取病虫加10mLPBS溶液充分研磨，再加入四氯化碳和乙醚各2mL，继续研磨，匀浆后用三层纱布过滤，经反复冻融3次后，4℃下差速离心，3000r/min离心10min去除细胞碎片留取上清液，5000r/min离心20min留上清，8000r/min离心30min，留上清。留取上清的病毒液可长期保存于-80℃中。

2.2 病毒的PCR鉴定2.2.1 病毒 NA的提取 按照 NA病毒提取试剂盒的说明书对已分离纯化的病毒液提取NA。再将提取的NA按照Trans Script All-in-One First-Strandc DNASynthesis Super Mixfor PCR将提取的NA反转录成cDNA。

2.2.2 IAPV引物设计与合成IAPV的全基因长度为9,487bp，使用Primer Premier 5.0软件根据IAPV的基因序列设计引物。

引物序列:(IAPV-F：5'-GGTGCCCTATTTAGGGTGAGGA-3')，(IAPV-R：5'-GGGAGTATTGCTTTCTTGTG-3')。

2.2.3 PCR检测反应体系25mL的PCR反应体系：以1μLcDNA为PCR的模板，各0.5μL的上游、下游引物，12.5μL的2×Easy Taq PCR Super Mix，ddH2O10.5μL混入离心管中放入PCR仪。PCR的反应程序:57℃退火30s，94℃预变性5min，94℃45s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min；反应结束后将PC R的产物在琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确定电泳条带大小正确后送天津金唯智公司进行测序，并对其进行blast分析比对。……