枯草芽孢杆菌发酵制备花生饼粕、花生茎叶混合饲料条件优化研究

迟吉捷石太渊

(辽宁省农业科学院食品与加工研究所,辽宁 沈阳 110161)

花生是我国主要的油料作物,国家统计局信息显示2019 年我国花生年产量约1 750 万t,居世界首位,花生在油料产业具有重要的地位。花生富含油脂、蛋白、维生素及多种矿物质,营养全面,具有保护心脑血管、降脂、降糖、抗癌、抗衰老等保健作用。近几年,我国花生用于食品加工的比例在逐年提升,已接近年产量的50% 。目前,我国花生仍以榨油为主,花生种植、加工过程中会产生大量的花生粕、花生红衣、花生壳、根茎等副产物,其中花生饼粕850 万t/年、花生茎叶1 800 万t/年以上,这些副产物中富含酚类、蛋白质、糖类等营养成分,但目前利用率却较低。对这些副产物进行综合利用及精深加工,不仅可以延长产业链,提高花生的经济价值,还可以减少资源浪费,避免因副产物废弃而造成环境污染[1～3]。

花生饼粕的营养价值比较高其代谢能量是所有饼粕类饲料中最高的,粗蛋白质含量接近大豆粕,高达45%以上,粗纤维7%左右。精氨酸含量高达5.2%,是所有动、植物饲料中最高的。赖氨酸含量只有大豆饼粕的50%左右,蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸含量都较低。通过添加合成氨基酸或是添加其他的蛋白质饲料而使氨基酸得到平衡,畜禽的生长性能也可达到理想水平[4～6]。

花生茎叶中营养物质丰富,花生茎叶中含有12.9%粗蛋白质、2%粗脂肪、46.8%碳水化合物,其中花生叶的粗蛋白质含量高达20%。

花生秧中的粗蛋白质含量是豌豆秧的1.6 倍、稻草的6 倍,畜禽采食1 kg 花生秧产生的能量相当于0.6 kg大麦所产生的能量。

花生饼粕以及花生茎叶很容易感染黄曲霉菌而产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素种类较多,其中毒性最大的是黄曲霉毒素B1。蒸煮、干热对去除黄曲霉毒素无效,因此,对花生粕中黄曲霉毒素含量应进行严格的检测,国家卫生标准规定黄曲酶毒素的允许量需低于0.05 mg/kg。黄曲霉菌毒素易使猪的肝脏受到损害。少量的黄曲霉毒素就可对猪的生长性能产生显著的影响。

花生饼粕和花生茎叶中的黄曲霉毒素及蛋白质组分的不理想,在复合饲料中添加量一般在10%左右,限制了饲料中的高效利用。因此,提高花生粕和花生茎叶的质量安全和品质,才能饲料行业中充分利用。目前,在豆粕饲料中利用枯草芽孢杆菌研究营养和安全方面研究很多,但对花生粕、花生茎叶的相关研究较少[7～9]。

本研究以花生饼粕和花生茎叶为原料,采用固态发酵法,研究了枯草芽孢杆菌对花生粕和花生茎叶的发酵条件,得到最佳工艺,这对花生饼粕和花生茎叶在饲料行业中进一步利用提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料 枯草芽孢杆菌1389 中国农业微生物菌种保藏中心提供;热榨花生饼粕和花生茎叶市场购买。

1.1.2 培养基 枯草芽孢杆菌斜面培养基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L,NaC1 5 g/L,琼脂 2 g/L,pH 值7.0;

枯草芽孢杆菌液体活化培养基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L,NaC1 5 g/L,pH 值7.0;

枯草芽孢杆菌芽孢平板计数培养基:酵母浸粉2.5 g/L 蛋白胨5 g/L,葡萄糖1.0 g/L,琼脂1.5 g/L,pH值7.0。

固体培养基:用植物粉碎机粉碎花生粕和花生茎叶,颗粒大小为120 目。按每250 ml 培养瓶中加入25 g 固体(20 g 花生饼粕+5 g 花生茎叶)。以上培养基均121 ℃下灭菌20 min 备用。

1.2 试验方法

1.2.1 固态发酵工艺流程 花生饼粕粉+花生茎叶粉→灭菌→冷却→接菌→发酵→烘干→ 平板培养→芽孢数量→最佳发酵条件。

1.2.2 芽孢培养计数方法 取0.5 g 发酵物干燥产品加入到4.5 ml 无菌水中,在80 ℃恒温水浴中,经10 min 灭枯草芽孢杆菌后3 000 r/min,离心10 min,上清液稀释106 倍,取200 μl 菌液涂板培养15 h 后检测枯草芽孢杆菌芽孢数。

1.2.3 单因素试验设计 调查以不同的料液比、接种量、发酵温度、发酵时间和花生茎叶量为因素对枯草芽孢杆菌芽孢数目的影响。

1.2.3.1 料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响 取20 g 花生饼粕和5 g 花生茎叶,加2 g 菌样,发酵温度为30 ℃,发酵时间为72 h,每隔12 h 搅拌1 次,分别加15、20、25、30、35 ml,料液比分别为1 ∶0.56,1 ∶0.74,1 ∶0.92,1 ∶1.11,1 ∶1.30 测定样品的芽孢数。

1.2.3.2 接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响 取20 g 花生饼粕和5 g 花生茎叶,发酵温度为30 ℃,发酵时间为72 h,每隔12 h 搅拌1 次,加25 ml 水,分别接种0.25 g (接菌量为0.50%)、0.50 g (接菌量为1.0%)、1.00 g(接菌量为2.0%)、1.5 g(接菌量为3.0%)、2.0 g(接菌量为4.0%)、2.5 g(接菌量5.0%)(枯草芽孢杆菌芽孢数为1.2×108个/g)菌量,测定样品的芽孢数。

1.2.3.3 培养时间对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响 取20 g 花生饼粕和5 g 花生茎叶,加0.5 g 菌样和25 ml 水,培养温度为30 ℃,每隔12 h 搅拌1 次,分别培养24、36、48、60、72、84 h 枯草芽孢杆菌,测定样品芽孢数。

1.2.3.4 培养温度对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响 取20 g 花生饼粕和5 g 花生茎叶,加0.5 g 菌样和25 ml 水,培养时间为72 h,每隔12 h 搅拌1 次,分别在24、26、28、30、32、34 ℃下培养,测定样品的芽孢数。

1.2.3.5 花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响取20 g 花生饼粕,加0.5 g 菌样和25 ml 水,培养时间为72 h,培养温度为30 ℃,每隔12 h 搅拌1 次,分别加0、2.5、5.0、7.5、10 g 的花生茎叶粉,测定样品的芽孢数。

1.2.4 响应面法试验设计 以单因素试验数据为依据,采用Box-Behnken 试验设计方法,对料液比(A)、接种量(B)、培养温度(C)和培养时间(D)等4 个因素,设计4因素3 水平的试验方案[10～15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响 由图1 中可以看出,料液比对花生饼粕中的枯草芽孢杆菌发酵有较大影响,料液比1 ∶0.92(加水量为25 ml)时枯草芽孢杆菌芽孢数量最高(芽孢数118.6×107个/g)。这很可能是因为枯草芽孢杆菌是好氧菌,料液比大时水中氧气含量偏低,满足不了枯草芽孢杆菌生长,导致枯草芽孢杆菌芽孢数量减少。相反,料液比小虽然可以满足枯草芽孢杆菌氧气需求,但营养物质浓度过小,也影响枯草芽孢杆菌生长。

图1 料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure 1 Influence of the ratio of feed to liquid on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.2 接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响 由图2 可以看出,随着接菌量的增加,发酵后的花生饼粕混合料中的芽孢杆菌芽孢数量呈现先增后降的趋势,接菌量0.5 g 时产生的草芽孢杆菌芽孢数量最多,达到2.3×107个/g,随着接菌量增大,反而抑制枯草芽孢杆菌的繁殖。

图2 接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure 2 The influence of inoculation amount on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.3 枯草芽孢杆菌种培养时间对芽孢数量的影响由图3 看出,枯草芽孢杆菌种培养时间对芽孢杆菌芽孢繁殖有明显的影响,随着培养时间延长枯草芽孢杆菌芽孢数量呈现先增后降的趋势,培养时间在24～36 h 之间时,枯草杆菌繁殖缓慢,芽孢数量也较少,随着培养时间的增长,枯草芽孢杆菌的繁殖速度明显提高,培养时间到72 h 时达到高峰,枯草杆菌芽孢数为4.53×107个/g,芽孢杆菌进入衰亡期,芽孢数量明显下降。

图3 接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure 3 The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.4 发酵温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响 由图4 可以看出,培养温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量有明显的影响,随着培养温度升高枯草芽孢杆菌的繁殖先增后降的趋势,芽孢数目呈现先升高后培养温度在30 ℃范围内时,枯草芽孢杆菌芽孢数量最高,达到枯草杆菌芽孢数为28.5×107个/g。

图4 温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure 4 The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis

2.1.5 花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响

由图5 可以看出,花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌繁殖有一定影响,但不明显。花生茎叶添加含量5 g 时枯草芽孢杆菌芽孢数量最多,达到0.42×107个/g。这可能与不同的花生茎叶含量改变枯草芽孢杆菌生长环境有关。适合地添加花生茎叶改善了发酵花生饼粕的透气性和碳、氮含量,有利于芽孢杆菌生长,否则花生茎叶添加量过多或过少都不利于枯草芽孢杆菌繁殖。

2.2 响应面法培养条件优化

在花生饼粕以及茎叶的枯草芽孢杆菌培养单因素试验基础上,采用Box-Behnken 组合设计,以枯草芽孢杆菌芽孢数为响应值,以加水量、培养时间、接菌量、培养温度为自变量因素,进行响应面试验,优化花生饼粕以及茎叶的枯草芽孢杆菌培养条件,试验设计和分析采用应用Design-Expert 8.0.6 数据分析软件,试验设计与结果见表2。

图5 花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure 5 The influence of Stem and leaf content of peanut on the spore quantity of Bacillus subtilis

表1 响应面分析因数与水平试验设计Table 1 Response surface analysis factors and horizontal test design

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface test design and results

枯草芽孢杆菌芽孢数所得回归方程为:

Y=179.00-37.33X1+19.25X2+11.92X3+15.17X4+15.50X1X2-17.75X1X3-34.25X1X4+16.50X2X3-20.75X2X4+24.50X3X4-55.96X12-29.33X22-40.08X32-50.21X42

由表3 可看出,“Prob＞F”值小于0.01,表明回归方程极显著,而且各因数之问差异很显著,说明该试验方法是可靠有效的。模型R2值为0.9730,失拟项P值为0.0534大于0.05,说明回归方程拟合程度良好,试验误差小,可以利用该方程预测枯草芽孢杆菌芽孢数的理论数值。通过比较回归方程中的各因数显著性分析,可判断各因数的作用大小,枯草芽孢杆芽孢数影响的大小依次为加水量、培养时间、培养温度、接菌量。

由图6 可知,响应面曲线越陡,相互作用的因素对花生饼粕、花生茎叶混合饲料中培养枯草芽孢杆菌芽孢数的影响越显著,该结果与方差分析结果一致。通过回归方程可以得到最优的预测值,即加水量(料液比)1 ∶0.83、培养时间时间62.15 h、接菌量0.78、培养温度30.76 ℃,此条件下枯草芽孢杆菌芽孢数理论值195.225。结合实际工作,优化工艺参数,即加水量(料液比)1 ∶0.83、培养时间62 h、接菌量0.78、培养温度30 ℃,枯草芽孢杆菌芽孢数为195.222±0.003,所得参数比较为可靠。

表3 枯草芽孢杆菌芽孢数量回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation of Bacillus subtilis spore quantity

图6 工艺参数对枯草芽孢杆菌芽孢数量影响的响应面Figure 6 Response surface diagram of the influence of process parameters on Bacillus subtilis spore

3 结论

3.1 在单因素试验的基础上,结合响应面分析法优化了各参数,并确定了花生饼粕、花生茎叶混合饲料中培养枯草芽孢杆菌的最优培养条件:加水量(料液比)1 ∶0.83、培养时间时间62 h、接菌量0.78 g、培养温度30 ℃,在该条件下所得枯草芽孢杆菌芽孢数为(195.222±0.003)。

3.2 实验结果表明,对培养枯草芽孢杆菌芽孢数影响的大小依次为加水量、培养时间、培养温度、接菌量。

3.3 优化枯草芽孢杆菌在花生饼粕、花生茎叶混合饲料中培养工艺效果好,培养枯草芽孢杆菌芽孢数量较多。为以后的花生饼粕和花生茎叶的利用提供理论依据。