LC-MS/MS法测定卡格列净二甲双胍复方制剂基因毒杂质

陈轶嘉,胡楚红,王建伟

(1.杭州华东医药集团新药研究院有限公司,浙江 杭州 310011;2.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

卡格列净(国际通用名:Canagliflozin,Invokana)是首个获批的钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2,Sodium-glucose co-transporter 2)抑制药。SGLT-2抑制剂是一种前端新型降糖药,主要通过抑制肾脏中肾小管对葡萄糖重吸收,促使机体内多余的葡萄糖从尿液中排出,从而降低血糖含量,改善胰岛β细胞功能,促使肝糖输出恢复正常[1-6]。多项研究结果表明:卡格列净在降低空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)和控制血糖水平方面均表现出很好的疗效,是一种非常有竞争潜能的降糖药物,并且安全性高。二甲双胍是一种II型糖尿病的常规治疗药物,临床试验证明它可以降低肝糖原生成和体内对糖的吸收并促进身体对糖的利用度,从而达到控制血糖的效果[7-9]。鉴于糖尿病的侵略性,很多病人最终需要通过多种渠道对血糖加以控制。卡格列净加二甲双胍复方制剂是SGLT-2抑制剂加双胍类药物的复方制剂,利用卡格列净和二甲双胍的作用互补促进机制,用于强化血糖控制。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

安捷伦高效液相质谱联用仪(Agilent 1260 HPLC-6470 QQQ),梅特勒XS205电子分析天平。

1.2 药品与试剂

卡格列净二甲双胍复方制剂样品:50 mg/500 mg规格(片均质量约为780 mg)样品(厂家自制,批号181002-S,181003-S,181101,复方制剂);杂质J对照品(LOT:20171130,质量分数99.5%);试剂:乙酸铵(ACS,LOT:95C1612UG,质量分数98%);甲酸(ACS,LOT:75C1710LL,质量分数99%);乙腈(ACS,色谱纯)。

2 方案与结果

2.1 色谱仪器条件

色谱柱:InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1×100 mm,2.7 μm)。流动相A相为甲酸-乙酸铵混合液(甲酸体积分数0.1%、乙酸铵浓度5 mmol/L),B相为乙腈;流速0.4 mL/min,柱温40 ℃,进样量10 μL,流动相梯度见表1。

表1 流动相梯度

后运行时间为3 min,预计杂质出峰时间为4.7 min。离子源:AJS ESI;扫描模式:MRM;极性:正离子;增益:400。基因毒杂质J离子对及相关参数见表2。离子源参数:干燥气温度300 ℃;干燥气流速6 L/min;鞘气温度350 ℃;鞘气流速11 L/min;毛细管电压3 500 V;喷嘴电压500 V;雾化气压力310 kPa。

表2 离子对及相关参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 稀 释 液

称取乙酸铵约0.38 g,加水1 L溶解,摇匀,超声使其溶解,得5 mmol乙酸铵;取等体积的乙酸铵与乙腈混匀,得乙酸铵稀释液,即空白溶液。

2.2.2 杂质J储备液

精密称取基因毒性杂质J适量,置量瓶中,加稀释液至刻度线,摇匀,得113.5 ng/mL的对照品杂质J储备液,即单杂储备液。

2.2.3 杂质J对照品溶液

精密量取113.5 ng/mL杂质储备液2 mL,置于50 mL量瓶中,加稀释液至刻度,摇匀作为4.54 ng/mL的杂质J对照品溶液,即系统适用性溶液。

2.2.4 专属性溶液

分别取辅料、卡格列净原料、二甲双胍原料和杂质J母液溶液各适量,加稀释液配制成卡格列净、二甲双胍和杂质J 100%限度浓度的混合溶液,作为专属性溶液。

2.2.5 供试品溶液

供试品溶液:取卡格列净二甲双胍复方片(50 mg/500 mg)20片,精密称定,研细,精密称取390 mg(约相当于卡格列净25 mg),置25 mL量瓶中,加稀释液适量,超声10 min使其溶解,冷却,加稀释液至刻度,摇匀。在13 000 r/min下离心15 min,取上清液作为1 mg/mL卡格列净二甲双胍复方片供试品溶液。

2.3 专属性试验

取2.2节方法所配的空白溶液、杂质对照溶液和专属性溶液各1 μL,在2.1节色谱条件下分别进样,记录色谱图,LC-MS/MS色谱图见图1。由图1可知:在上述色谱条件下,空白溶剂不干扰测定,卡格列净二甲双胍复方制剂中主成份卡格列净、二甲双胍与基因毒杂质J出峰时间无干扰,无任何其他检测干扰。

图1 LC-MS/MS色谱图

2.4 线性关系考察

精密称取约120 mg辅料和约250 mg二甲双胍(相当于卡格列净25 mg制剂配比)共6份,分别置于25 mL量瓶中,加适量稀释剂,分别加入适量杂质J对照品储备液,确保其最终定容后为定量限LOQ,10%,50%,100%,150%和200%基因毒杂质限度质量浓度溶液。超声10 min,冷却至室温,用上述稀释剂稀释至刻度,摇匀,在13 000 r/min转速下离心10 min,取上清液,得6份线性溶液。由峰面积对溶液质量浓度线性回归,得回归线性方程y=2 228.380 5x+43.219 6,基因毒杂质J质量浓度为0.09～9.08 ng/mL时与峰面积积分值呈良好的线性关系,相关系数R2=0.999 8。

2.5 检测限与定量限

精密称取120 mg辅料和250 mg二甲双胍(相当于卡格列净25 mg的制剂配比)若干份,分别置于25 mL量瓶中,加稀释剂适量,分别加入适量杂质J对照品储备液,确保其最终定容后为一定质量浓度的基因毒性杂质J限度质量浓度溶液。超声10 min,冷却至室温,用上述稀释剂稀释至刻度,摇匀,在13 000 r/min转速下离心10 min,取上清液,得相应质量浓度溶液,按2.1节色谱条件进样测定,得到信噪比S/N约为3的检测限质量浓度0.022 7 ng/mL,信噪比S/N约为10的定量限质量浓度0.090 8 ng/mL。

2.6 加样回收率试验

称取卡格列净二甲双胍复方片(批号:181002-S)细粉末390 mg(相当于卡格列净25 mg),精密称定,共2份,按照2.2.5节方法配制得到2份供试品溶液,作为样品空白对照。称取该批次卡格列净二甲双胍复方细粉390 mg,精密称定,共9份,分别置于50 mL量瓶中,加适量稀释液,精密量取杂质J对照品储备液0.5,1.0,1.5 mL,各平行3份,加入。超声10 min使其溶解,冷却,加稀释液至刻度,摇匀,在13 000 r/min 转速下离心15 min,取上清液作为基因毒性杂质回收率50%,100%和150%的供试品溶液各3份。按2.1节色谱条件进样测定,根据杂质J加入与测得量计算回收率和RSD,结果见表3,总平均回收率为95.70%,总RSD为2.54%,表明回收率良好。

表3 杂质J回收率试验结果

2.7 精密度试验

称取卡格列净二甲双胍复方片(批号:181002-S)细粉390 mg(相当于卡格列净25 mg),精密称定,共6份,分别置于25 mL量瓶中,加稀释液适量,精密量取杂质J对照品储备液2 mL分别加入。超声10 min使其溶解,冷却,加稀释液至刻度,摇匀,在13 000 r/min转速下离心15 min,取上清液作为基因毒杂质的100%限度质量浓度溶液6份。按2.1节色谱条件进样测定,计算回收率和RSD,杂质J的加入量为4.54 ng/mL,平均回收率为90.97%,RSD为1.16%,结果见表4,由表4可知精密度较高。

表4 精密度试验结果

2.8 稳定性试验

精密称取卡格列净二甲双胍复方(批号:181002-S)细粉390 mg,加入一定量的杂质J储备液制含有基因毒杂质限度质量浓度100%的杂质溶液,分别在0,4,6,8,10,12 h进样。按2.1节色谱条件进样测定,测得基因毒杂质限度质量浓度的RSD为1.67%,说明该杂质溶液在12 h内基本保持稳定。

2.9 样品测定

取3批样品,按2.2.5节方法配制供试品溶液,按2.1节色谱条件进样测定,结果见表5。

表5 3批样品的检测结果

3 结 论