人参二醇对APP-SH-SY5Y细胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信号通路的影响

梁喜才 蔺莹 肖洪贺 孔亮 杨静娴

摘要目的：研究人參二醇（PD）对转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y）中Tau 蛋白磷酸化的影响及其作用机制。方法：采用分子对接技术验证PD 与非受体酪氨酸激酶Fyn 的靶向性。在体外培养SH-SY5Y 细胞，构建APP-SH-SY5Y细胞模型和绿色荧光蛋白（GFP）-SH-SY5Y细胞模型（对照细胞），通过检测细胞中β淀粉样蛋白（Aβ1-42）的表达来验证APP-SH-SY5Y细胞模型是否构建成功。以GFP-SH-SY5Y细胞为对照，采用CCK-8 法检测5、10、20、30、40 μmol/L 的PD 和125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的PP2（Fyn 抑制剂，阳性对照）作用24 h 对APP-SH-SY5Y细胞存活率的影响，以确定最佳给药浓度。以APP-SH-SY5Y细胞为对象，分别检测最佳浓度PD、PP2 作用24 后细胞中Ca2+浓度及磷酸化Tau 蛋白（p-Tau）/Tau、磷酸化非受体酪氨酸激酶Src（p-Src）/Fyn、磷酸化谷氨酸受体2B（p-GluN2B）/GluN2B比值。结果：分子模拟对接结果显示，PD可靶向结合Fyn 蛋白。与GFP-SH-SY5Y细胞比较，APP-SH-SY5Y细胞中Aβ1-42蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。PD和PP2 的最佳作用浓度分别为20 μmol/L和500 nmol/L。20 μmol/L PD、500 nmol/L PP2 均可显著升高细胞的存活率，显著降低细胞中Ca2+浓度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。结论：PD可通过抑制Fyn/GluN2B信号通路来降低APP-SH-SY5Y细胞中Ca2+浓度及Tau蛋白的磷酸化水平。

关键词人参二醇;转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y;Tau 蛋白;磷酸化;非受体酪氨酸激酶Fyn/谷氨酸受体2B信号通路

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects and mechanism of panaxadiol（PD） on Tau protein phosphorylation in theSH-SY5Y cells transfected with APP gene（APP-SH-SY5Y）. METHODS：The target of PD and non-receptor tyrosine kinases Fynwas verified by molecular docking. SH-SY5Y cells were cultured in vitro，and the APP-SH-SY5Y cell models and green fluorescent（GFP）-SH-SY5Y cell model（control cell）was constructed. The expression of Aβ 1-42 was detected so as to verify the success ofAPP-SH-SY5Y cell model. Taking GFP-SH-SY5Y cells as control，the effects of 5，10，20，30，40 μmol/L PD and 125，250，500，1 000，2 000 nmol/L PP2（Fyn inhibitor，positive control）on the survival rate of APP-SH-SY5Y cells were detected byCCK-8 assay after treated for 24 h， so as to confirm the optimal concentration. The concentration of Ca2 + ， the ratiofophosphorylated Tau protein（p-Tau）/Tau，phosphorylatedn Src（p-Src）/Fyn and phosphorylated glutamate receptor2B（p-GluN2B）/GluN2B were detected in APP-SH-SY5Y cells after trated with the optimal concentration of PD and PP2 for 24 h. RESULTS：Theresults of molecular simulation docking showed that PD could target Fyn protein. Compared with GFP-SH-SY5Y cells，the proteinexpression of Aβ1-42 in APP-SH-SY5Y cell were increased significantly（P<0.01）. The optimal concentration of PD and PP2 were20 μmol/L and 500 nmol/L. The 20 μmol/L PD and 500 nmol/L PP2 could increase the survival rate of the cells and reduced theconcentration of Ca2 + ，the ratio of p-Tau/Tau，p-Src/Fyn，and p-GluN2B/GluN2B. CONCLUSIONS：PD can reduce the thephosphorylation of Tau protein through inhibiting Fyn/GluN2B signaling pathway.

KEYWORDS Panaxadiol;APP-SH-SY5Y cells;Tau protein;Phosphorylation;Fyn/GluN2B signaling pathway

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种进行性的神经退行性疾病，患者通常会出现以记忆力衰退、学习能力减弱为主的症状，并伴有情绪调节障碍以及运动能力丧失[1]。目前主流观点认为，AD的病因与β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）和Tau 蛋白过度磷酸化造成的神经元大量死亡而导致的认知缺陷有关[2]。其中，Tau 蛋白的过度磷酸化是由Aβ神经毒性引起的病理生理级联反应，而磷酸化的Tau 蛋白同样影响着Aβ的沉积，进一步协同产生神经毒性，形成恶性循环，最终导致神经系统衰竭、神经变性和认知能力下降[3-4]。已有研究证实，Aβ可通过激活非受体酪氨酸激酶Fyn 并开放谷氨酸受体2B（GluN2B）通道，引起Ca2+大量内流，进一步诱导Tau 蛋白的过度磷酸化[5-8]。……