紫椴种子休眠的影响因素

臧思航，张永鑫，范春楠，郭忠玲

(北华大学林学院，吉林 吉林 132013)

种子休眠是指在一定时间内，具有活力的种子在一定范围的生态环境因子(光照、水分、温度等)组合下不能发芽的现象[1-2].林木种子只有在适宜的环境条件下才能进行能量转换，为保证种群延续，种子会形成抵抗不良环境的生理生态学特性以及遗传变异[3-4].种子休眠就是一种自我保护的生物学特性，是在长期的系统发育和进化过程中对于季节变化形成的主动适应[5].Baskin C C将种子休眠分为内因性休眠(生理后熟、内源抑制因素)和外因性休眠(物理因素).外源因素包括机械束缚、水分吸收不畅、气体交换被干扰等；内源因素包括胚的形态后熟、存在萌发抑制物和形态发育不完整等[4，6].研究种子休眠机理有助于采取打破休眠的有效方法，快速获得种苗，对植物开发与利用具有重要意义.

紫椴(Tiliaamurensis)属椴树科(Tiliaceae)椴树属落叶乔木，是我国东北地区珍贵的用材树种、蜜源植物[7]，在保障木材生产、发展林业经济等方面发挥着重要作用.然而，受长期采伐、生境退化及自身生物学特性导致的天然更新不良等因素影响，紫椴的种群数量逐年下降，蓄积大幅减少，种质资源日渐濒危[8-9]，已被列为国家二级保护树种.目前，紫椴种子休眠的原因还不完全清楚.杜凤国等[10]通过紫椴种子解剖发现，种子柱状石细胞层下的黄色石细胞层排列紧密，种皮结构比较致密，水分和空气难以通过种皮进入内部.种子各部位都有抑制幼苗生长的物质，因此，紫椴种子在自然状态下很难生长[11-12].研究发现，种皮透性不良是造成其休眠的主要原因之一.种皮影响空气与水分交换，但并不影响种子吸水膨胀.邹学忠等[13]的研究表明，紫椴种子属于深度休眠类型，其种皮透性较差，果皮、种皮与胚乳中存在的休眠抑制物质是导致其休眠的主要原因；杨艳华等[14]的研究表明，胚乳是阻碍种子萌发的原因，在种子休眠过程中，胚乳内的TCA和PPP途径被抑制，造成种子休眠难以破除.考虑到种皮透性与胚休眠问题，在播种前经酸蚀、激素处理并结合变温层积可将种子的发芽率提高到87%[15].本文通过试验研究紫椴种子休眠的影响因素，从而为椴树属树种资源培育提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 研究材料

紫椴种子来自吉林省林木种子调制储备中心，种源为吉林省临江种源，采种时间为2019年9月.种源地位于吉林省东南部的长白山腹地，属中温带大陆性季风气候，年平均气温2～4 ℃，年降水量750～1 000 mm.试验前，先将紫椴种子除去果梗与杂物，再挑选籽粒饱满的种子作为供试材料.

1.2 研究方法

1.2.1 种皮透水性

选取当年采摘的颗粒饱满、自然阴干的紫椴种子500粒，每50粒为一组，其中，250粒为完整种子，其余种子划破种皮.测定初始质量，将种子投入盛有蒸馏水的烧杯中，在室温条件下自然吸水(22 ℃左右).每隔24 h取出种子，用纸巾将种子表面的水分吸干，再用电子天平称其质量.试验设5组重复，用种子的净增质量表示种皮的透水性.

1.2.2 种子萌发抑制物质活性

手工剥离收集的紫椴种子，参照陈伟等[15]的方法分别取完整的紫椴种子、果皮、胚各20 g，用粉碎机粉碎，加蒸馏水100 mL，置于60 ℃恒温箱内浸提24 h，过滤后得到浸提液母液(100%母液)；将母液分别加水稀释为25%母液、50%母液，以蒸馏水为对照，每种浓度设3个重复.由于白菜(Brassicachinensis)种子无休眠特性且易萌发，因此，用其作为萌发抑制物质活性的生物鉴定种子.取直径9 cm的一次性无菌培养皿，以滤纸为萌发床，每个培养皿加入3 mL浸提液，均匀摆入50粒已浸泡4 h的白菜种子，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，24 h测量白菜种子发芽率，48 h后测量胚根长.

1.2.3 种子萌发进程

以鲜种子为材料，设置3种处理方式(A：完整种子，B：去除果皮，C：同时去除果皮与种皮)，在光照培养箱中试验，培养温度25 ℃，以脱脂棉为萌发床.培养容器为直径15 cm的玻璃培养皿，放入高压灭菌锅灭菌处理40 min.每种处理种子分别用升汞消毒(处理A：10 min，处理B：8 min，处理C：5 min)，再经无菌水多次冲洗.摆放种子过程在超净工作台上进行，每个处理30粒种子，3个重复.培养期间保证苗床湿润，每2 d观测种子萌发情况，以胚根突破种皮为萌发标准，去除种皮的以长出胚芽为萌发标准，统计种子发芽率.

2 结果与分析

2.1 种皮透水性

种子净吸水量随时间的变化情况见图1.由单位时间吸水量变化可以看出：0～2 d为快速吸水期，50粒种子平均每天的总净吸水量为1.383 4 g，约为0.027 7 g/粒；2～12 d为缓慢吸水期，平均每天的净吸水量为0.080 1 g；12 d以后为吸水停滞期，种子质量不再增加，接近吸水饱和状态.紫椴种子因种皮较为致密导致吸水饱和周期较长，但不存在不能吸水的情况.

图1 紫椴种子吸水过程Fig.1 Water absorption process of Tilia amurensis

刺破种皮的种子与完整种子每隔24 h的吸水率变化见图2.由图2可见：完整种子在3 d后吸水率基本不再增加，刺破种皮的种子至第5天吸水率无明显变化.2～4 d刺破种皮的种子透水性强于完整种子的透水性；5～10 d完整种子的吸水率无明显变化，平均每天增加2.12%，刺破种子可打破结构上致密的屏障，但种子的持水能力也随之下降，5～10 d刺破种皮的种子吸水率变化呈波浪状.综上可知，紫椴种子虽然吸水缓慢但是不存在不能吸水的问题，种子透水性不良是导致紫椴种子休眠的原因之一，但并不是主要原因，此结果与刘艳秋[17]对紫椴种子种皮透水性的研究结果一致.种皮在一定程度上阻碍了种子吸水，进而影响种子萌发，但其不是影响种子萌发的主要因素.

图2 紫椴完整种子和刺破种皮种子的吸水率 Fig.2 Water absorption of Tilia amurensis seeds with intact and punctured seed coats

2.2 种子萌发抑制物质活性

萌发抑制物质的存在是导致种子休眠的重要原因.张洁等[18]对紫椴种子抑制物质的研究表明，紫椴种子的果皮、种皮以及胚中均含有萌发抑制物质.以浸提液对易萌发种子进行处理是常用的抑制物质生物鉴定方法，而白菜种子因具有无休眠且易萌发的特性，常用作指示种子.紫椴萌发抑制物质活性方差分析结果见表1.由表1可见：紫椴种子部位、浸种时间以及浸提液浓度对白菜种子的萌发均有极显著影响.

表1 紫椴抑制物质活性方差分析Tab.1 Variance analysis of inhibitor activity of Tilia amurensis

大写字母表示组间差异，小写字母表示组内差异.图3 紫椴种子各部位不同浓度浸提液对白菜种子发芽率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of extracts from Tilia amurensis seeds on germination rate of cabbage seeds

紫椴种子各部位不同浓度浸提液对白菜种子发芽率的影响见图3.由图3可见：紫椴种子各部位浸提液对白菜种子的萌发均有抑制作用，且随着浓度的增大，抑制活性也逐渐增强.3种处理中，果皮浸提液对其抑制作用最强.浸提液体积分数为25%时，白菜种子在紫椴完整种子、果皮、胚浸提液处理下的萌发率分别为71.67%、62.67%、73.33%，均低于对照(92.67%)；浸提液体积分数为50%时，白菜种子在紫椴完整种子、果皮、胚浸提液处理下的萌发率分别为58.67%、40.67%、59.33%；浸提液体积分数为100%时，白菜在紫椴完整种子、果皮、胚浸提液处理下的种子萌发率分别为44.00%、10.67%、44.67%.由此可见，紫椴种子内含有一定的萌发抑制物质，且胚中抑制物质含量低于果皮中所含抑制物质含量.

不同部位紫椴种子浸提液对白菜种子萌发的影响见表2.由表2可见：紫椴种子各部位浸提液对白菜种子芽和胚根的伸长具有抑制作用，这种抑制作用根据部位与浸提液浓度的不同而呈现差异.随着浓度的提高，施加3种浸提液的白菜种子芽长均呈下降趋势，抑制活性为胚>完整种子>果皮；对于胚来说，随着浓度的提高，施加3种浸提液的白菜种子的胚根长均呈下降趋势，抑制活性为胚>完整种子>果皮.50%的果皮浸提液对白菜种子胚根的伸长不具有抑制作用，白菜种子胚根长(14.44 mm)与对照组的胚根长(14.95 mm)相差甚微；25%果皮浸提液处理的白菜种子胚根长(15.17 mm)高于对照组，此体积分数下的浸提液对胚根伸长起到了一定的促进作用.

表2 不同部位紫椴种子浸提液对白菜种子萌发的影响Tab.2 Effects of different parts of Tilia amurensis seed extracts on germination of cabbage seeds

大写字母表示组间差异，小写字母表示组内差异.图4 不同浸种时间紫椴种子浸提液对白菜种子发芽率的影响Fig.4 Effects of different soaking times of Tilia amurensis seed extracts on germination rate of cabbage seeds

浸种是一种常用的催芽方法.通过不同浸种时间紫椴种子浸提液对白菜种子发芽率的影响研究抑制物质含量的动态变化，结果见图4.由图4可见：完整的紫椴种子浸提液对白菜种子发芽率的影响呈先上升后下降继而再上升的趋势，浸种9 d，白菜种子的发芽率达到峰值(88.67%)，推测紫椴种子内的抑制物质含量在浸种9 d最低.通过分离种子的各个部位，分别以不同水浸时间的果皮和胚浸提液进行抑制物质生物鉴定，结果表明：果皮浸提液浸种6 d白菜种子的发芽率达到最大(95.33%)，且高于对照组(92.67%)，推测此时果皮中的抑制物质基本消失；种胚浸提液浸种8 d白菜种子发芽率达到最大(76.67%)，但远低于对照组的白菜种子发芽率(92.67%)，此时的抑制物质含量虽然相对降低，但是还有一大部分存在于种胚当中.综上可知，浸种可以降低抑制物质含量，且在浸种6 d左右种子果皮中的抑制物质全部溶解于水；浸种8 d，种胚中的抑制物质含量最低；提高种子发芽率的最佳浸种时间为9 d.

2.3 种子萌发进程

不同处理种子萌发进程见图5.由图5可见：对照组的种子在整个观测期间没有萌发现象；去除果皮的种子，在3～7 d萌发较快，发芽率为6.67%，7～15 d发芽速率逐渐减缓，15 d发芽率达到最大值，为10.81%；去除果皮和种皮的种子在1～7 d发芽率逐渐增加，前后共增长了11.12%，第7天达到最大值，发芽率为16.67%，染菌达到75%以上，经再次消毒后种子萌发数没有增加.

图5 不同处理种子萌发进程Fig.5 Seed germination process of different treatments

3 结论和讨论

种子中的水分是保持种子生命活力的重要物质，参与种子的呼吸与代谢.研究发现，紫椴种子的种皮对种子吸水膨胀有一定的阻碍作用.王海南[19]的研究表明，完整种子与刺破种皮的种子在吸水方面差异显著，但吸水时间仅有10 h.本次研究增加了浸种时间，通过观察10 d内的完整种子与刺破种皮的种子吸水率变化可知，在短期内(0～4 d)刺破种皮的种子吸水较快.总体来看，紫椴种子虽然吸水缓慢但是不存在不能吸水的问题，虽然种子透水性不良是导致紫椴种子休眠的原因之一，但并不是主要原因.许晓岗[20]对垂珠花种子透水性的研究结果表明，热水处理与机械刻伤处理的种子与对照组的吸水率在58 h后大致相当，说明种皮透水性不良并不是制约种子萌发的主要原因；邹威等[21]研究显示，黑樱桃种子的外种皮虽然会影响种子的吸水速率，但是10 h后，当种子吸水至恒重时，剥去种皮与完整种子的吸水率差异不大，种皮障碍并不是黑樱桃种子休眠的原因.

学者们指出，萌发抑制物质是导致紫椴种子休眠的主要原因.本研究在证实紫椴种子中存在抑制物质的基础上，对种子各部位的抑制物质活性进行了比较.结果显示，胚中抑制物质含量低于果皮中抑制物质含量.紫椴种子各部位浸提液对白菜种子的芽和胚根的伸长具有抑制作用，这种抑制作用根据部位与浸提液浓度的不同而呈现差异，抑制性为胚>完整种子>果皮.

某些抑制物质易溶于水，浸种可以降低抑制物质含量，如水稻、小麦等种子中的抑制物质可以通过流水冲洗去除.在对紫椴种子进行浸种后发现，浸种6 d左右，经种子果皮浸提液处理的白菜种子发芽率最高，推测此时种子中的抑制物质全部溶解于水中；浸种8 d，经种胚浸提液处理的白菜种子发芽率最高，说明经过8 d浸种可使胚中的抑制物质从胚中转移出去.综合来看，最佳浸种时间为9 d.