烟草环斑病毒RT－PCR检测体系的优化

郇晓雪，刘晓宇*，房乐，杜传印，李广强，耿超，李向东，田延平

（1.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018；2.山东潍坊烟草公司，山东 潍坊 261061；3.枣庄市农业农村事业发展中心，山东 枣庄 277899）

烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属（Nepovirus）代表种［1，2］，1927年首次发现于美国。目前TRSV已在50多个国家发生，是我国公布的二类进境检疫有害生物［3］。其粒子为球形，基因组含两条线形正义ssRNA，其中RNA1编码复制酶，RNA2编码运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）［4，5］。

TRSV寄主范围广泛，能够侵染大豆（Glycine max）、马铃薯（Solanum tuberosum）以及烟草（Nicotiana tabacum）等54科300多种植物［6－9］，可通过种子、嫁接以及介体传播。TRSV的传播介体包括美洲剑线虫（Xiphinema americanum）［10－12］、烟蓟马（Thrips tabaci）、烟草跳甲（Epitrix hirtipennis）、蚜虫（Myzus persicae）等［13－15］。张满良等［16］报道了TRSV在渭北地区烟草上的危害，证明该病毒可通过蚜虫和种子传播，但不同烟草品种的种子带毒率有差异。种子和无性繁殖材料是TRSV远距离传播的重要方式［17］。2003—2008年我国2次在进口大豆中检测到TRSV［18］。2007年闻伟刚等［19］从美国进口大豆中检测到TRSV。2009、2010年文朝慧等［20，21］分别在荷兰萝卜种子和番茄种子中检测到TRSV。

TRSV的准确检测是对检疫工作的一项挑战。血清学方法和RT－PCR方法是鉴定该病毒的重要手段［22］。但血清学检测存在一定的不足，虽然绝大多数TRSV分离物具有相同的血清学关系，但发现至少存在4种具有不同血清学关系的株系，而且TRSV与该属亚组的马铃薯黑环斑病毒存在血清学相关性［14］。IC－RT－PCR结合了血清学和RT－PCR技术优点，但血清学上的交叉反应和潜在的错检漏检也给TRSV准确检测带来隐患。李桂芬等［23］研制的DAS－ELISA试剂盒检测纯化病毒灵敏度为15.625 ng／mL。……