菝葜丛生芽诱导初探

黎娇凌， 陈 菊， 李玉红

(黔南民族师范学院生物科学与农学院， 贵州 都匀 558000)

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金刚藤，金刚果，铁菱角，为菝葜科(Smila caceae)菝葜属(SmilaxL.)攀援灌木。菝葜为常用中药材，以根茎入药、具有祛风湿、利小便、消肿毒的功效，用于治疗外科急性感染(疖、痈、蜂窝组织炎)、风湿性关节炎、牛皮癣、癌肿等[1]。被广泛用于治疗妇科疾患、关节疼痛、肌肉麻木、痢疾、水肿、淋病、疔疮、肿毒、痔疮等症[2]。应用菝葜研制的金刚藤糖浆和金刚藤胶囊是我国治疗妇科病的品牌良药[3-4]。此外，菝葜的果色红艳，嫩芽鲜红(可食用)，树形优美，叶形奇特，耐寒性强等，可用于攀附岩石、 假山，也可作地面覆盖，是一种良好的观赏植物，可以作为南方地区立体绿化树种[5]。张晨曦[6]研究表明，菝葜叶提取物有较强的抑菌作用，为增加菝葜的应用价值提供了理论依据。菝葜主要靠自然分蘖或实生繁殖，但分蘖能力及种子发芽率低，扦插和嫁接较难成活[7]，且其药用部位为其繁殖部位根茎。因野生资源破坏严重，为了更好地开发利用这一野生资源，有不少研究者对菝葜开展了研究，大多数研究集中在菝葜的种质资源调查、化学成分、主要成分的提取及分析方法和药理作用[8-9]，仅有少数几个研究了菝葜的组织培养技术[10-11]，但繁殖率较低。为了优化菝葜的组织培养技术体系，提高菝葜组织培养效率，本实验通过不同方法研究菝葜丛生芽的诱导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1实验材料

以采自都匀斗篷山野生菝葜的幼嫩茎段和带芽根状茎为实验材料。

1.1.2试 剂

MS培养基(不含琼脂和蔗糖)、琼脂粉均为化学纯，购于青岛海博技术有限公司；蔗糖为西陇牌分析纯试剂；6-BA，IBA，NAA均购于上海蓝秀生物科技公司生产的规格为1 g，BR级试剂。

1.2 方 法

1.2.1不同消毒方法

外植体采用菝葜当年生枝条，经预处理后切成约2 cm长带芽节段置超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s、45 s后分别在0.1%的升汞溶液中浸泡3 min、5 min、7 min和9 min。然后用无菌水冲洗5次，每次1 min。最后去除外植体基部被消毒剂浸泡的部位，并留取约1.5 cm接种于培养基中。

1.2.2不同激素配比

采用当年生带芽茎段、茎尖及带芽根状茎，预处理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用无菌水冲洗5次(每次1 min)后，无菌接种于培养基中培养。以MS为基本培养基，并添加不同浓度的6-BA、NAA和IBA(具体浓度处理见表2)。蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，pH值5.8。

1.2.3不同外植体

采用当年生带芽茎段、茎尖及带芽根状茎，预处理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用无菌水冲洗5次(每次1 min)后，无菌接种于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培养基中。

1.2.4不同防褐化处理

外植体在预处理之后，分别在抗坏血酸(0.5 g·L-1)、PVP(2 g·L-1)、半胱氨酸(0.1 g·L-1)中浸泡20 min，以不浸泡为对照处理。在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用无菌水冲洗5次(每次1 min)后，无菌纸吸干水分后接种于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培养基中。

1.2.5不同季节、时期取材

分别在春、夏、秋季取当年生枝条，枝条经预处理后切成约2 cm长带芽节段，用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min后于超净工作台上用75%酒精短时浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液处理7 min，用无菌水冲洗5次，每次1 min。去除外植体基部被消毒剂浸泡的部位并留取约1.5 cm接种于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培养基上。

所有处理经洗衣粉水浸泡5 min，流水下冲洗2 h后，每处理按10个芽，重复3次，于(25±2)℃，光照强度1 500～3 000 lx，每天光照12 h。培养第15天、第25天各记录一次，第30天后统计诱导情况。

2 结果与分析

2.1 消毒时间对外植体污染率的影响

不同消毒剂和消毒时间对外植体的影响较大。正确选择消毒剂的浓度和处理时间可以降低污染率，尽量减少组织死亡，提高外植体的萌发率。具体结果见表1。

表1 不同消毒处理对菝葜丛生芽诱导的影响Table 1 Effects of different disinfection treatments on the induction of cluster buds of S. china

从表1可以看出，处理4的污染率最低，并与处理1、2、6差异显著，且芽的萌发率也最低，与其他5个处理均达显著差异；而处理2、3、5的污染率也很低，综合3种处理的萌发率可知，处理2的萌发率最高，并与处理3、5达显著差异。因此，菝葜带芽茎段最佳消毒方式是75%酒精浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液处理7 min。

2.2 不同激素配比对丛生芽诱导的影响

在MS基本培养基上，选用6-BA、NAA和IBA共3种植物激素，9种组合处理。 3种不同激素配比培养基对菝葜的诱导影响结果见表2。从表2可以看出，发芽率最高的分别是处理5、6、8，与其他处理均达到显著差异。其中处理8的发芽率最高，但是芽扭曲畸形，而处理5的芽较处理6长势好，综合比较处理5对菝葜的丛生芽诱导效果最好。因此,菝葜丛生芽诱导的最佳配方为MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)。

表2 不同激素配比对丛生芽诱导的影响Table 2 Effects of different hormone ratios on the induction of cluster buds of S. china

2.3 不同外植体丛生芽诱导

同一种植物不同部位外植体的丛生芽萌发能力不一样，通过不同外植体实验研究最适合的外植体，具体结果见表3。

接种后的第15天统计结果显示，茎尖芽萌发的速度最快，茎段芽萌发的速度稍慢而根状茎最慢。第30天后的结果(表3)显示，带芽茎段、茎尖都能有效诱导丛生芽，两者无显著差异，且丛生芽生长情况较好，其中茎尖的萌发率最高，但是带芽茎段最易获得，且萌发的芽全部发育成丛生芽；茎尖一个枝条只有一个而且并不是所有的芽全部发育为丛生芽；根状茎前期易褐化而影响萌发，因此发芽率很低，与茎段和茎尖的萌发率差异显著，芽萌发后长势也一般且材料不易获得。综上，菝葜丛生芽诱导的最佳外植体是带芽茎段。

表3 不同外植体丛生芽诱导比较Table 3 Comparison of multiple shoots induction from different explants

2.4 几种防褐化处理对外植体褐变的影响

菝葜外植体接种后易褐化，影响萌发甚至导致死亡，用3种不同防褐化剂处理后结果见表4。从表4可以看出，3种处理的褐化率都低于对照并达到显著水平，对降低外植体的褐变率有明显的作用。其中以PVP(2 g·L-1)浸泡的效果较为明显，褐变率最低且与其他处理均达到显著差异。

表4 不同外植体预处理防褐化比较Table 4 Pretreatment comparasion of different explants against browning

2.5 不同季节取材对萌发率和污染率的影响

在菝葜新生枝条的春季和生长旺盛季节的夏、秋季取外植体，结果表明，春季取材的外植体丛生芽的萌发率最高，污染率最低，且达到显著差异。因此，最佳的取材季节为春季。具体见表5。

表5 不同季节取材处理Table 5 Comparison of sampling and treatment in different seasons

3 讨论与结论

菝葜的外植体相对比较光滑，因此在外植体的预处理和消毒灭菌中，采用比较常规的方式就能取得很好的效果。

菝葜根状茎含有较多的多酚化合物，在培养过程中较易褐化影响其萌发率。而且根状茎是菝葜药用的主要部位，因此不建议作为组培快繁的外植体。菝葜幼嫩茎段在组培中也同样容易褐化，从而影响其萌发率。采取一些防褐化处理能大大降低其褐化率从而提高外植体的成活率。

植物内源激素的调控是丛生芽成功诱导的重要因素。外植体组织中内源激素水平不同，引起培养基中最适外源生长物质浓度的变化[11]。因此，不同植物的组织培养有不同生长物质种类及浓度的需要。在菝葜丛生芽诱导试验中，适当的分裂素和生长素浓度对菝葜丛生芽的分化有很大的影响。配比过低不利于丛生芽的诱导萌发，配比过高则会导致丛生芽产生畸形影响其生长，这与梁崇等[12]研究同属植物土茯苓的结果一致。生长素NAA对于丛生芽的诱导效果要优于IBA。本实验细胞分裂素只用了一种，两种细胞分裂素共同作用是否更有利于菝葜丛生芽的诱导有待进一步研究。

图1 菝葜丛生芽培养过程Fig.1 Cultivation proces of multiple shoots of S. china

在菝葜生长最为旺盛的夏、秋两季，夏季由于温度较高，其他有害微生物的繁殖速度也较快，因此容易污染从而影响发芽率；秋季可能由于其体内的有效物质积累到了较高水平，因此酚类物质的含量也较多，外植体易褐化从而影响其成活率。

本研究表明，菝葜丛生芽诱导的最佳方法为：以菝葜带芽茎段为外植体、用洗衣粉水浸泡5 min，流水下冲洗2 h后用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min，然后于超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞处理7 min后无菌水清洗5次。接种于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1培养基中。于光照强度1 500～3 000 lx(每天光照12 h)，25 ℃下培养。