保护地番茄根结线虫的病原鉴定及抗性材料筛选

刘丹 尚春明 杨进 张仙保 潘子旺 刘燕 郑于莉

摘要 以根结线虫病样、番茄品种及组合为试材，采集包头市根结线虫暴发地一个根结线虫病样，进行形态学和分子生物学鉴定;利用PCR技术对24个番茄品种及组合进行Mi-1基因扩增筛选。结果表明，感染内蒙古包头市番茄的根结线虫为南方根结线虫;筛选出3个纯合抗根结线虫番茄组合。抗感品种及组合均产生750 bp的特异片段，纯合抗病基因的番茄组合存在TaqⅠ酶切位点，酶切后产生了570和160 bp特异性片段，为防治当地番茄根结线虫及培育抗病品种积累材料。

关键词 番茄;根结线虫;分子生物学

中图分类号 S-433.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）12-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Pathogen Identification and Resistant Material Screening of Tomato Root knot Nematode in Protected Field

LIU Dan1， SHANG Chun ming1， YANG  Jin2 et al

（1.Baotou Institute of Agricultural Science， Baotou， Inner Mongolia 014013; 2. Inner Mongolia Agricultural University， Baotou， Inner Mongolia  014013）

Abstract Taking the root knot nematode samples and tomato varieties and combinations as test materials， a root knot nematode disease sample from the root knot nematode outbreak area in Baotou City was collected for morphological and molecular biological identification. The Mi 1 gene amplification and screening of 24 tomato varieties and combinations were carried out by PCR technology. The results showed that the root knot nematode infected tomato in Baotou City of Inner Mongolia was the southern root knot line， three homozygous tomato combinations with resistance to root knot nematode were screened out. The resistant varieties and combinations all produced 750 bp specific fragments. The Taq I restriction site existed in the homozygous resistant tomato combinations， and 570 and 160 bp specific fragments were produced after enzyme digestion， which were used to accumulate materials for the control of local tomato root knot nematode and the cultivation of disease resistant varieties

Key words Tomato;Root knot nematode;Molecular biology

根結线虫是一类在农作物上危害极大的植物寄生性线虫。据不完全统计，世界各地农作物因根结线虫危害，平均每年可使农业减产24.5%，造成经济损失在1 000亿美元以上[1]。目前，报道近百种根结线虫有效种，能够寄生的植物达3 000多种，其中最常见造成危害最严重的线虫有南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫[2]。

近年来，随着种植结构的调整，保护地蔬菜复种指数越来越高，致使根结线虫病危害日趋严重，造成蔬菜大幅减产[3]。保护地番茄栽培面积相对较大，抗根结线虫病的番茄品种相对缺乏，已成为生产上急需解决的问题[4]。内蒙古自治区随着蔬菜供应量不断增加，根结线虫也迅速发展和蔓延[5]。根结线虫已成为一类严重危害番茄且具有广泛寄主的植物寄生线虫。利用抗线虫品种，是最为经济、有效、安全的根结线虫防控途径。目前已知的番茄抗根结线虫病的主要基因是Mi基因家族，该家族包含9个抗性基因，分别为 Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9，其中 Mi-1、Mi-3、Mi-7、Mi-8 表现为不耐高温;Mi-2、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9 表现为耐高温[6]。目前Mi-1 基因是唯一一个被商业化利用的基因，可抗3种线虫，在栽培番茄中具有很高的应用价值[7]。 根结线虫的防治主要有物理防治、化学防治、生物防治以及种植抗性品种等策略[8-9]。抗性基因为番茄抗根结线虫的育种提供了丰富的遗传资源，筛选抗根结线虫病的番茄品种显得尤为重要。近十几年来，分子生物学技术的发展，为根结线虫的准确鉴定及抗病材料的筛选提供了重要手段。戴均涛等[10]利用 SCAR快速鉴定检测番茄Mi基因的有无。吴媛媛等[11]利用与番茄根结线虫病抗病基因 Mi 紧密联锁的 CAPS 标记进行抗病材料的检测，证明所筛选的材料属于单基因控制的质量性状遗传位点。王孝宣等[12]利用Mutiplex-CAPS技术同时检测番茄抗根结线虫基因（Mi）和抗叶霉病基因（Cf5）。韩娜等[13]采用酶切扩增多态性序列方法对国内市场上的26个番茄品种进行Mi检测，筛选出含有纯合Mi基因的品种。防治番茄根结线虫危害的理想途径是培育和利用抗虫番茄品种。通过PCR技术，能够快速检测番茄材料是否含有Mi基因，有助于筛选抗虫材料，加快抗虫番茄育种。

笔者采集内蒙古包头市根结线虫主要暴发地的番茄根结线虫病样，通过形态鉴别法结合分子生物学技术进行根结线虫种类鉴定及抗病品种及组合的筛选，旨在明确该地区番茄根结线虫的种类并筛选抗病品种及组合，为当地番茄根结线虫病的有效防治提供理论依据及培育番茄抗根结线虫新品种积累材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

受根结线虫感染的番茄根部组织，采自内蒙古包头市农大职业技术学校大棚，在发病地块，随机取20株番茄根系，所采样品统一保存于4 ℃冰箱，供试的大部分番茄品种及组合为包头市农牧业科学研究院自行选育。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定 。

将发病的番茄根系清洗干净，分离被侵染的番茄根组织中的雌虫，分离出单头雌虫，制作会阴花纹并观察，参照张靠稳等[14]、冯志新[15]的方法稍作修改。挑取雌成虫放入滴有一滴1%肥皂水的载玻片上，用解剖刀从虫体后部约1/3处轻轻切下，再将其后部杂物用针尖轻轻清除干净，使其切口向下，将后部展开，做成临时装片，在显微镜下观察其会阴花纹，进行形态学鉴定。

1.2.2 病原线虫基因组提取。

病原线虫DNA提取，参照思彬彬等[16]的方法并稍作修改，取6 μL DNA样品于1.0%琼脂糖凝胶中电泳分离，以检测DNA的浓度。

1.2.3 特异性引物。

通用引物M18s/M28s参照冯光泉等[17]设计，南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫特异性引物参照张锋等[18]设计。番茄Mi-1基因引物设计参照李君明等[19]设计（表1）。

1.2.4 PCR扩增及酶切体系。

（1）引物M18s/M28s对供试线虫ITS的PCR扩增。引物M18s/M28s的PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物5 μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并拍照。

（2）引物MI-F/MI-R对南方根结线虫的特异性PCR扩

增。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物5 μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并拍照。

（3）番茄抗病材料Mi-1基因的PCR扩增体系及酶切体系。PCR反應体系50 μL，包括 24 μL 10×PCR bufferr（0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs），上下游引物各1 μL，1 μL DNA模板，最后加无菌双蒸水至50 μL。扩增条件参照李君明等[19]的方法。

酶切体系为PCR扩增产物10.0 μL加入 10 U 的 Taq I 酶0.5 μL，Buffer 1.5 μL，终体积加超纯水至 25.0 μL，65 ℃ 保温1 h。PCR产物及酶切产物于2.0% 琼脂糖凝胶在电压80～100 V 条件下电泳45 min，以100 bp DNA Marker 为标准分子量，用凝胶成像仪观察。

2 结果与分析

2.1 会阴花纹形态学观察

从番茄根部挑取根结线虫，再随机挑取20头雌成虫逐一进行形态特征观察，通过形态鉴定发现，雌成虫会阴花纹背弓高，近方形，顶部平，平滑略呈波浪形，无明显侧线，线纹在侧区处有间断和分岔。对照文献资料[1]，观察到的这些特征与南方根结线虫雌成虫的特征一致，初步确认导致包头市郊区保护地番茄根结线虫病发生的病原为南方根结线虫（图1、2）。

2.2 引物MI-F/MI-R对南方根结线虫的特异性PCR扩增

参照冯光泉等[17]方法提取根结线虫DNA。利用线虫通用引物M18s/M28s对供试线虫ITS的PCR扩增结果表明，扩增到长度为544 bp的片段，片段之间没有多态性，表明提取各采样点的线虫DNA均成功，可用于后续分析（图3）。利用特异性引物对根结线虫DNA进行PCR扩增，由图4可知，南方根结线虫特异性引物的扩增呈阳性，得到一条大小约900 bp碱基对的扩增片段;其他3个特异性引物未扩增出条带。将PCR产物直接送测序公司测序，在基因库中将该序列与已知南方根结线虫序列进行BLAST同源性分析（Accesion no.MN444135.1），相似性达99.69%，由此确定包头市郊区保护地番茄根结线虫的病原为南方根结线虫。

2.3 番茄抗性材料Mi-1基因检测

由图5A和5B可知，利用番茄抗根结线虫特异性引物SCAR F/SCAR R对供试的424份番茄品种及组合进行Mi-1基因PCR扩增与检测，无论抗感品种及组合均能检测出一条750 bp特异性片段;PCR扩增产物经TaqⅠ酶切后，抗病纯合基因型存在酶切位点，其中编号5、6、7的6份番茄组合均产生了570和160 bp 2条特异性片段，为纯合显性Mi-1/Mi-1抗病材料，产生了570和160 bp 2条特异性片段，其余编号的PCR产物不能被TaqⅠ酶消解，即不含显性Mi-1基因，其基因型为纯合隐性基因mi-1/mi-1（表2）。

3 结论与讨论

根结线虫病是危害国内外番茄生产的重要病害，对根结线虫种类进行准确的鉴定和检测成为防治该病的前提条件，随着分子生物学的发展，运用传统形态学分类方法并结合PCR技术，能够快速准确地鉴定根结线虫种类，且鉴定结果准确可靠[20]。通过采集番茄发病根部组织的根结线虫样本，制作根结线虫会阴花纹，从番茄根部组织分离的线虫经ITS扩增，南方根结线虫特异性引物MI-F/MI-R对根结线虫DNA进行PCR扩增、凝胶回收、测序及BLAST比对，此结果表明侵染内蒙古包头市郊区保护地番茄的主要根结线虫属于南方根结线虫。在此次鉴定中，未发现其他根结线虫合并侵染的情况，目前发现包头市郊区只有东河沙尔沁发生根结线虫，导致采集的样本不丰富，在以后的工作中需要不断定时监测及做好防治工作。

根结线虫已成为内蒙古赤峰市保护地主要病害，对番茄造成严重的产量损失，包头市郊区番茄根结线虫已成为逐渐发展态势，选育抗线虫品种是解决这一难题的根本途径。该研究通过对24份番茄品种及组合进行Mi-1基因分子检测，共筛选出3份纯合抗病组合。3份纯合抗病组合含570、160 bp 2条特异性片段，其余21份材料只含750 bp片段。这些材料中是否还含有其他Mi家族的基因还需进一步研究，同时在筛选材料的同时，发现有些材料没有Mi-1基因，其基因型尚未可知。筛选出的纯合番茄抗病组合为番茄抗根结线虫育种亲本的选择提供抗性资源信息，将加快抗病品种的选育。

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