CaMKⅡ调控脂多糖诱导的心肌细胞内钙、ROS的作用机制研究

巩奇明，李德慧，龚元勋，姜艳

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院科学实验中心，广西 百色 533000)

脓毒症是临床常见的炎症反应综合征。心肌炎是该综合征常见的并发症之一，可导致心力衰竭以及患者死亡[1]。心肌炎主要表现为细胞内线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，炎症因子大量分泌，细胞内钙超载和细胞凋亡等[2]。目前，对心肌炎发病机制的研究仍不够全面和深入。

钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶[3]，也是钙/钙调蛋白依赖性蛋白(Ca2+/CaM)信号通路的关键调节酶[4]，参与心肌细胞死亡、心肌肥大、炎症反应、缺血再灌注以及心律失常等多种病理过程[3-8]。但是目前CaMK Ⅱ在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的心肌细胞损伤中的分子调控机制尚不明确。

本研究采用LPS(细胞炎症反应和凋亡的主要启动因子)构建体外心肌细胞炎症模型，通过观察抑制CaMK Ⅱ是否对LPS所致心肌细胞胞浆钙含量及ROS水平具有调控作用，从中探讨CaMK Ⅱ在该作用中的具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 大鼠心肌细胞(H9C2)购自上海中乔新舟生物公司。

1.1.2 主要试剂 高糖型DMEM培养基(C1199-5500BT，Gibco)；胎牛血清(FSP500，ExCell Bio)；qPCR SYBR Green Master Mix (11201ES08，翊圣)；RT First Starand cDNA 第一链合成试剂盒(D71-68M，碧云天)；LPS (L2880，Sigma)；PCR引物合成(上海捷瑞)；EDTA-胰蛋白酶(25200056，Gibco)；KN93(HY-15465，MCE)；钙离子荧光探针(Fluo-3 AM，40703ES50，翊圣)；Hanks平衡盐溶液(HBSS，60161ES76，翊圣)；活性氧ROS试剂盒(s0033s，碧云天)；多克隆兔抗CaMK Ⅱ、单克隆鼠抗GAPDH、山羊抗兔IgG (H+L) HRP、山羊抗鼠IgG (H+L) HRP (AF6434、T0001、S0001、S0002、Affinity Biosciences)、BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、ECL化学发光溶液均购自上海雅酶公司。

1.2 细胞分组与建模 在37℃，5% CO2条件下，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞。待细胞生长至80%～90%时，消化，离心，重悬，计数，接种于孔板或平皿中(接种密度6孔板为2×105个/孔；……