不同食品标准中沙门氏菌分类方案比较

苏章庭 曾晓琮 刘秋婷 刘单单 钟卫烨 段星星 周露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

沙门菌氏广泛分布于自然界，寄生于人和动物体内，亦常见于污染的蛋、奶及其制品、肉类、食品、饲料、水产品和污水等外环境。沙门氏菌是最常见的食源性致病微生物之一。据统计，在世界各类细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌引起的食物中毒事件常列榜首。沙门氏菌感染不仅在发展中国家有较高发病率，在发达国家也存在同样的情况，并且在低收入国家造成更高的死亡率。目前，一旦感染沙门氏菌，会给发展中国家和工业化国家带来了沉重的经济负担。中国内陆地区的食物中毒事件也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌可以引起人类伤寒、副伤寒和胃肠炎、败血症和局部感染等许多疾病。

沙门氏菌本身并不能自行传播，需要特定媒介才能传播到其他环境。如食品、鸟类迁徙、污水等都会造成污染物的转移。这些污染物主要来自粪便，所以还包含了许多除了沙门氏菌外的其他病原体。因此，沙门氏菌的流行病学和粪便污染的流行病学密切相关，并可以由此得出其他病原体的传播途径，包括一些人畜共患病的微生物，如小肠耶尔森菌、单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭菌，甚至还有一些寄生虫和病毒等[1]。由于全球化的发展，世界各地区之间的人流物流日益广泛和频繁，病原体也随之迅速扩散，并且不像以前要由邻接地区由近而远地扩散，而是直接跨越地区造成国家之间乃至洲之间的迅速扩散，很难从流行的表面发现其内在联系[2]。研究由沙门菌引起的食源性疾病，为了寻找其传播来源与传播链，不仅需要现场流行病学调查，还需要对病原体进行详尽地检测与分析，对病原细菌进行科学的分类和分型，一方面有利于揭示食源性疾病的本质，另一方面可以对爆发源头进行溯源。因此，建立一套科学的分类方案和快速、敏感的分型技术对于传染源的追踪、溯源、爆发疫情的鉴定以及最终有效地控制疫情意义重大[3]。

2 沙门氏菌的定义

2.1 肠杆菌科

肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌是常见的人类微生物之一，是影响肠道微生态的重要菌科，其中包括很多可导致食品腐败的细菌和某些肠道病原菌。肠杆菌科属于细菌界、变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目肠杆菌科。1937年Rahn提出建立肠杆菌科以来，所含属的范围经历了多次变动，现有的分类方法将其划分为44属与8个未分类的群。其主要表型特征可见表1[4]。

表1 肠杆菌科的主要表型特征

对肠杆菌科细菌的定义，只能代表大多数菌属及菌种的表型特征。随着对肠杆菌科细菌的进一步认识以及科内菌属及菌种的不断增多，使学术界对肠杆菌科细菌的定义不断发生变化。总体上讲，长期以来对肠杆菌科细菌的定义，主要是依据其形态特征、鞭毛生长及动力、有无荚膜及芽孢、代谢类型、氧化酶及过氧化氢酶的产生、生长条件、生境及致病作用等方面予以概述。

2.2 沙门氏菌属

沙门氏菌是肠杆菌科的重要成员，对于沙门氏菌的定义一直以来都在不断完善。在Edwards和Ewing所著《肠杆菌科的鉴定》当中，沙门氏菌属的定义是：“沙门氏菌属为符合肠杆菌科和沙门氏菌族定义的有动力的细菌所组成。不产生尿素酶，不利用丙二酸钠，不液化明胶，在含氰化钾培基中不生长。对赖氨酸、精氨酸和乌氨酸有脱羧作用。在Jordan氏酒石酸钾钠培养基中产酸。能发酵卫矛醇，多数菌株能利用肌醇，不发酵蔗糖，水杨苷，棉子糖和乳糖。代表种为猪霍乱沙门氏菌。”

族（Tribes）是介于科与属之间的分类级别。沙门氏菌族是符合肠杆菌科定义的有动力的细菌。主要的生化现象包括甲基红反应阳性、VP试验阴性、不形成靛基质、苯丙氨酸不脱氨、在营养培基中不能迅速液化明胶。除少数例外，能产生大量的硫化氢，在Simmons氏枸橼酸盐和醋酸钠培养基上能生长，能形成精氨酸双水解酶，在能发酵的碳水化合物中产气，不能水解七叶苷，不发酵赤藓醇和侧金盏花醇[5]。

《伯杰氏细菌鉴定手册》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology）第七版和第八版中所列的族和各族所包括的属有很显著的变动。在第七版中，埃希氏族包括埃希氏属、肠杆菌属（Enterobactor）和克雷伯氏菌属 （Klebsiella），而沙门氏菌属（Salmonella）和志贺氏菌属（Shigella）则包括在沙门氏菌族中。在第八版中，沙门氏菌族被删去。克雷伯氏菌属放在克雷伯氏菌族中，沙门氏菌属和志贺氏菌属都转到埃希氏菌族中[6-7]。

《伯杰氏系统细菌手册》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）第二版对于沙门氏菌属，族的概念已经不再应用。沙门氏菌属的定义为“沙门氏菌属应该符合肠杆菌科的一般定义。形态直杆，0.7-1.5×2.0-5.0μm，革兰氏阴性。通常以周生鞭毛运动。兼性厌氧。有机化能异养，具有呼吸和发酵两种代谢类型。最适宜生长温度为37℃。菌落的直径通常为2～4 mm。DNA的G+C%的摩尔分数是50～53。模式种为猪霍乱沙门氏菌，生化反应通常为D-葡萄糖产气，TSI产硫化氢，吲哚和VP反应阴性。可利用柠檬酸盐作为碳源。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶反应通常为阳性，苯丙氨酸和色氨酸脱羧酶、脂肪酶、DNA酶阴性，不能水解尿素。通常不发酵蔗糖、水杨素、肌醇和苦杏仁苷，对人类有致病性，可引起肠热、胃肠炎和败血病，也可以感染多种动物物种，是一些血清病毒严格的宿主[8]。”

3 沙门氏菌分类与命名

3.1 沙门氏菌的分类

3.1.1分类方案

沙门氏菌属的分类有过多种方案，其不同的分类指标涵盖了表型方法，血清学特征，数值分类学和DNA同源性等。在早期的分类方案发展过程中，主要是通过生化反应将沙门氏菌分成亚群（subgroup）。Kauffmann-White方案使用生化反应对沙门氏菌进行系统分类。最终确定了5种由生化反应定义的亚属（I至V）。在这个分类方案中，每一种血清型被定义为一个种。其中，亚利桑那菌属被列入亚属III中。随后，Ewing提出了一个3种命名系统，使用16种生化试验来鉴别伤寒沙门氏菌（S.typhi，单一血清型）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis，单一血清型）和肠炎沙门氏菌（S.enteritidis，所有其他沙门氏菌血清型）。该种方案认为亚利桑那菌属为一个独立的属。1973年Crosa等根据DNA-DNA杂合试验研究，认为沙门氏菌属4个亚属和亚利桑那的代表株高度相关。在遗传和进化观点上，认为所有的菌株属于同一个菌种。在生化反应、抗原结构、对宿主适应力和地理分布上的差异，是一个单一菌种内的离散，提议并入沙门氏菌属，这在沙门氏菌分类学上确立了一个发展方向。随后Le Minor等基于数值分类学和DNA亲缘关系提出了一个由7个亚种组成的单一种猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）。后来该方案进一步进行了修改（Le Minor和Popoff，1987），将猪霍乱沙门氏菌改名为肠炎沙门氏菌，对于其他7个亚种的名称予以保留。

通过使用多位点酶电泳技术（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE），邦戈尔沙门氏菌（S.bongori）从猪霍乱沙门氏菌中分离了出来并作为新的种（Reeves等，1989）。如今以下的命名法现已被国际学界正式接受（Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Prokaryotes，2005）：沙门氏菌属由2个种组成，分别是肠炎沙门氏菌（enterica，包含6个亚种）和邦戈尔沙门氏菌（bongori）。每个种都有多个血清型。亚种是根据生化性状和基因组亲缘关系来区分的。该分类方案也被《伯杰氏系统分类学手册》第二版所采用。沙门氏菌的各个时期的分类方案见表2[9-10]。

表2 沙门氏菌的不同分类方案

3.1.2分型方法

3.1.2.1表型分型

（1）血清学方法

今天使用的沙门氏菌的血清型分类主要是依据血清学方法中的凝集（agglomeration）反应作为判断依据。凝集反应是指颗粒抗原与相应的抗体结合后，可出现肉眼可见的凝集现象，根据凝集与否，判定样品是否存在待检的抗原或抗体，可作定性检测[11]。Kauffmann和White对抗体与细菌表面抗原相互作用研究后得出，沙门氏菌的3种表面抗原（O抗原、H抗原和Vi抗原）决定了对特异性抗血清的反应。利用沙门氏菌特异血清与其菌体表面的抗原与血清的反应，根据产生颗粒状凝集现象来判断对该种血清型凝集的阴阳性，通过查询沙门氏菌的Kauffmam-White血清表可以确认菌株的血清型。一般的沙门氏菌的鉴定血清试剂盒中含有O抗原和H抗原的多价血清和单价的血清，使用多价血清可以缩小菌株鉴定的范围，而后再使用单价血清进一步鉴定出菌株的血清型。某些的血清型可能是抗原变异的结果[12-15]。沙门氏菌血清型分布的历年数量变化见表3。

表3 血清型分布的历年数量变化[16-17]

（2）噬菌体方法

血清学对病原体的检测与鉴定主要是根据其表型特征进行区分的。随着研究的不断深入，在分析传染源、传播途径及阐明传染病流行规律等方面，一般的血清学表型研究已经不能满足流行病学研究的需要。而噬菌体分型具有能够区分沙门氏菌中相同血清型的分离株中的变种的能力。噬菌体是一种专性的细胞内寄生物，分为烈性噬菌体和温和噬菌体[18]。沙门氏菌表面具有噬菌体特异性受体，使得噬菌体的侵染具有高度特异性。通常一种噬菌体只能侵染沙门氏菌的某种血清型，甚至是同一血清型的特定菌株。因此，噬菌体分型可对血清型进行更细化的分类[19-21]。目前噬菌体分型已经应用于沙门氏菌的多个血清型。国际采用的噬菌体分型方案包括伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌[22]。伤寒噬菌体的型别比较稳定。在一个患者或带菌者体内多次分离的菌株，或在同一传染源引起的伤寒流行病例中，往往从各个病例中分离的菌株都是同一型别。一方面，沙门氏菌的噬菌体分型工作对追踪传染源和探索传播途径，在流行病学上有重要意义[23]。噬菌体分型的局限性在于可用于分型的噬菌体种类有限，使得许多菌株无法分型，从而限制了该技术区分菌株的能力。另一方面，噬菌体分型需要长期维持多种噬菌体储备。此外，为了获得准确的和可重复的分型结果，通常由参考实验室使用维护良好的噬菌体库和经过专门培训的专业人员进行噬菌体分型[24]。

3.1.2.2分子分型

既往对病原体的鉴定，主要定义到种级以及进一步的生物型别。这些鉴定依靠病原体的种属分类学、主要结构成分和数十个生化反应指标。然而具有相同表面标志和一些生化代谢指征的同种微生物，而在其基因组序列上会表现出很大的差异。因此，对一株病原体的特征定义，已从主要特征的描述和分类向全基因组序列的差异进行精细定义，从而更精准地区分出同种（型）的不同菌毒株[25]。随着分子生物学的快速发展，分子分型技术也逐步应用于沙门菌分型。

基于核酸序列沙门菌的分型方法中，常用的技术有脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分析（MLST）、多位点VNTR扩增的基因分型方法（MLVA）等。其中，PFGE技术在沙门菌中已应用成熟。PFGE技术不同于传统的表型分型技术，而是从DNA水平对病原菌进行鉴定分型，比较不同菌株产生的带型是否一致，以判断菌株间的相似性，为散发性传染病和暴发性传染病的溯源提供技术支持和数据参考。PFGE分型的主要优点是，该方法对于绝大多数菌株都具有高度可重复性，可以在多个实验室之间共享数据。目前，国际上已经以PEFG为基础建立了PulseNet对食源性疾病的病原菌进行监测，已在多次食物中毒的溯源调查中发挥了良好作用[26]。

3.2 沙门氏菌的命名

对于沙门氏菌的命名，早期命名强调病理学特征和分离菌株来源的动物种类，如伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、羊流产沙门氏菌等现仍用于临床细菌学，但是一种沙门氏菌引起的疾病并不限于一种动物，如牛沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌也可引起人类疾病。后又改为采用分离菌株来源的城镇、地区或国家名称命名，但此命名法不能体现进化亲缘关系。这一类的命名常常用于在人类或兽医学中常见的沙门氏菌。在其他细菌种类中（如大肠杆菌），尚未对血清型进行命名，其血清型直接由抗原式来进行表示。但是，常见的沙门氏菌血清型名称已经在业界长期广泛使用，以至于弃用这些名称而使用其抗原公式进行代替是不现实的。目前大部分的血清型集中在肠炎沙门氏菌的肠道亚种中，所以保留了肠道亚种血清型的名称[27-29]。

美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）使用如下的命名方法，见表4。

表4 美国CDC沙门氏菌命名法/书写方式

4 《伯杰氏系统分类学手册》分类方案

在1994年出版的《伯杰鉴定细菌学手册》第九版中，对沙门菌属的细菌进行了种（亚种、血清型）的划分，将沙门氏菌属分为了邦戈尔沙门菌、猪霍乱沙门茵2个种。在第2版《伯杰系统细菌学手册》（2005）采用了Reeves等在1989年提出的分类方案，将沙门氏菌属分为了邦戈尔沙门菌、肠炎沙门茵两个种。种与亚种之间的生化反应区别见表5。

表5 《伯杰氏系统分类学手册》分类方案

5 《GB 4789.4-2016食品微生物学检验 沙门氏菌检验》中沙门氏菌分类方案

《GB 4789.4-2016食品微生物学检验 沙门氏菌检验》使用了“生化群”的分类级别，将沙门氏菌依据生化反应分为6个生化群（见表6）。整体分类与国际主流分类方案相似，只是简化了部分生化反应，且未对亚利桑那亚种与双相亚利桑那亚种作出区分。但是在实际工作中，可以通过H相血清对亚利桑那亚种与双相亚利桑那亚种加以鉴别区分。亚利桑那亚种与双相亚利桑那亚种的主要生化区别是半乳糖醛酸、γ-谷氨酰转肽酶和β-葡糖苷酸酶的反应不同[30-31]。

表6 GB 4789.4-2016中沙门氏菌分类方案

6 《ISO 6579-1-2017食物链的微生物学.采用水平方法的沙门氏菌检测，计数和血清分型.检测沙门氏菌属》分类方案

从流行病学的角度，沙门氏菌可分为3类：

（1）仅感染人类的血清型：包括伤寒沙门氏菌（S.Typhi）和副伤寒沙门氏菌（S.Paratyphi）。该组细菌包括的细菌能够引起伤寒和副伤寒，这是沙门氏菌所能够引起的疾病中最严重的一种。伤寒热的潜伏期较长，能够引起高烧，以及具有较高的死亡率。

（2）特异宿主的血清型，主要对特定动物致病：包括鸡沙门氏菌（S.Gallinarum，家禽），都柏林沙门氏菌（S.Dublin，牛），马流产沙门氏菌（S.Abortus-equi，马），绵羊流产沙门氏菌（S.Abortus-ovis，绵羊）和猪霍乱沙门氏菌（S.Choleraesuis，猪），等等。

（3）无特异宿主的血清型：多数的沙门氏菌，都是这一类人及动物共染的病原菌；且动物宿主范围非常广泛。人可因食用患病动物的肉或被污染的食物而致病[32-33]。

临床中也有通过结合临床症状分为伤寒沙门氏菌（Typhoidal Salmonella）与非伤寒沙门氏菌（Non-Typhoidal Salmonella，NTS）。伤寒沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌肠炎亚种中的伤寒血清型和甲、乙、丙型副伤寒血清型。伤寒沙门氏菌是引起伤寒和副伤寒的病原细菌，主要体现为引起以发热为特征的全身性疾病。常见的并发症是中毒性肝炎和中毒性心肌炎，严重的并发症可有肠出血和肠穿孔等。非伤寒沙门氏菌主要诱发急性、自限性胃肠炎。少于10%的患者会发展成菌血症。食源性感染是人类NTS最常见的感染方式[34-35]。

ISO 6579-1：2017中，通过TSI，尿素，赖氨酸，β-半乳糖苷，吲哚进行一个初步的生化分类，以快速筛选出对危害较大的沙门氏菌血清型。其具体的分类方法见表7[36]。

表7 ISO 6579-1：2017对于部分沙门氏菌血清型的鉴定方法

7 结论

沙门氏菌的鉴定与分型可以对沙门菌感染疾病进行溯源，从而给予正确的临床针对性治疗。面对沙门菌感染事件，在短时间内对病原菌正确分类也有利于沙门菌感染病例进行有效管理。对于沙门氏菌的分类方案与命名方法，在不同时期一直处于变化当中。随着人们对病原细菌研究的不断深入，特别是分子生物学技术的广泛应用，沙门氏菌的分类与分型技术也将持续发展。及时关注细菌分类学的变化，规范使细菌学名，可以使得我们的鉴定结果更加准确、科学，从而进一步接轨国际上的研究工作，更好地促进学术间的交流。