荧光定量PCR鉴定胃酶种属来源质控方法研究

潘莎莎 郭睿 杨健 宋博 黄涛 李幸 朱栋 徐燕妮 戎春燕 汪庆燕 周翔

（常州千红生化制药股份有限公司 江苏常州 213125）

1 前言

胃酶由胃部的胃粘膜主细胞分泌的胃蛋白酶原在pH 1.5～5.0条件下活化而成，可将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。从猪、羊或牛的胃黏膜中提取的胃酶，均为白色或淡黄色的粉末，国内生化药厂常将其单独制成胃酶片或复方制剂，用于治疗消化不良、食欲不振等疾病。国家对于生化药品的原材料来源进行了相关规定，要求选择生化药品的原材料时需要根据实验目的确定原材料的种属和器官组织类别，同时选取的原材料必须具有一定的代表性[1]。根据相关要求，本文选择猪、牛、羊（包括绵羊和山羊）作为研究物种，通过设计针对这些物种基因的胃酶检测方法来确定胃酶种属来源。

本次研究主要依赖种属鉴别实验，围绕专属性和耐用性方面的问题，建立基于荧光定量PCR的方法来对胃酶种属来源开展质控研究，理论依据主要来自《药品质量标准分析方法验证指导原则》（中国药典2015年版四部通则9101）等相关标准规范和医学要典[2]。

2 方法原理

本次实验的主要目的在于探究胃酶种属来源问题。本文根据种属不同则基因序列不同这一基本原理，通过引物和探针并结合聚合酶链式反应来提取待研究物种基因组特有的基因序列并进行适度扩增，通过研究扩增曲线及未知样品的Ct值与起始模板拷贝数的数量对应关系来确定未知样品初始模板基因数量。

3 仪器与试剂

主要仪器为7500 Fast型实时定量PCR仪，检测器见表1。

表1 主要检测器

供试品主要是胃酶和基因标准品，其中胃酶采购自某生物制药有限公司，基因标准品主要是猪基因、牛基因和羊（含绵羊和山羊）基因；胃酶、基因标准品、纯化水和PCR试剂预制剂。

试剂盒是由Takara公司提供的DNAiso Reagent型。

为便于使用和标记，分别对采购自某生物公司的引物和探针做了编号，见表2。

表2 引物探针序列

4 测试方法

4.1 溶液配制

首先进行溶液配制包括基因提取液和上下游引物与探针溶液。

基因提取液的配制比较简单，主要是将供试品（酌量，本次实验中取25 mg为宜）和DNSiso Reagent（酌量，本次实验中取1 ml为宜）进行混合，并充分振荡，然后利用离心机在室温条件下将组织裂解液（10 000xg）进行离心操作10 min，并将上清转移至新的离心管中，至此裂解液中的组织碎片、RNA和多糖类成分基本都能被过滤出去。然后将DNAiso Reagent 1/2体积量的无水乙醇加入到裂解液中，进行摇匀操作，直到出现云雾状的DNA沉淀为止，这时使用枪头将DNA缠绕出来转移至新的离心管中，将DNA沉淀留在离心管底部。接着将75%乙醇（1 ml）沿离心管壁加入到离心管中，进行摇匀操作，在室温下离心5 min后将乙醇弃去，然后将基因组的DNA在室温下沉淀5～15 s，缓慢加入灭菌水溶解基因组DNA。

除了基因提取液，还需要配制上、下游引物与探针溶液。首先对上下游引物和探针溶液进行密封离心处理，离心处理完毕后，加入纯化水进行稀释，稀释到标准规定的浓度即行停止，留待他用。

进行各基因组标准品原液稀释时，向标准品原液中加入无核酸纯化水，按照标准曲线中对应的溶液刻度进行稀释，直到达到相应的浓度刻度值位置。其中，猪基因浓度有5个数量级，分别是6 000、600、60、6和3 pg/μL，牛和羊基因浓度对应着也有5个数量级，分别是6 000、600、60、0.6和0.3 pg/μL。

此外，还需要准备能够将基因浓度控制在15～100μg/mL的供试品溶液，以及浓度为6 ng/μL的猪基因溶液、浓度为0.06 ng/μL的牛基因溶液、浓度为0.06 ng/μL的绵羊基因溶液和浓度为0.06 ng/μL的山羊基因溶液。

4.2 测试程序

首先需要对20μL PCR体系进行适当的配置，主要是采用5μL的DNA模板（DNA标准品或样品或阴性空白溶液）与1μL的上游引物溶液（5μmol/L，终浓度是250 nmol/L）以及1μL的下游引物溶液（5 μmol/L，终浓度是250 nmol/L）进行混合，混合完毕后进行离心处理，离心完毕后依次加入20μL的纯化水、1μL的探针溶液（2μmol/L，终浓度是100 nmol/L），最后再加入10μL的PCR试剂预混液。然后，安装相关标准规范中的要求，设置PCR反应条件，具体见表3。

表3 PCR反应条件

4.3 数据分析

进行实验并采集到相关数据之后，需要利用这些数据对系统的适用性、专属性和耐用性进行分析和判断。首先需要对照标准曲线对应的刻度值，将各种不同浓度的DNA标准品进行Ct值扩增，直到达标为止；然后利用比较结果计算扩增效率，确保扩增效率在90%～110%（即标准曲线斜率应为-3.1～-3.6）范围内时，表示系统适用性符合要求。专属性判断主要是利用上下游引物和探针对猪（6 ng/μL）、牛（0.06 ng/μL）、羊（含绵羊和山羊，均为0.06 ng/μL）的基因组标准品和纯化水（即为无模板阴性对照）进行PCR扩增，利用扩增后的数据计算扩增效率。当扩增效率符合标准规定时，表示基因专属性达到了要求；耐用性判断主要是将供试品在室温下放置0 h、2 d、4 d、6 d之后，利用阴性对照（空白溶液）和阳性对照（6 ng/μL猪基因标准品溶液）作为对照组进行对比。当对比数据符合标准规定时，表示耐用性符合要求。

5 结果

5.1 标准曲线溶液系统适用性

对不同种属的DNA标准品扩增得到与Ct值相关的标准曲线和扩增效率计算，结果如图1所示。

图1 标准曲线和扩增效率计算结果

5.2 专属性

采用引物P-F、P-R、P-P、B-F、B-R、B-P、O-F、O-R、O-P、C-F、C-R、C-P对猪（6 ng/μL）、牛（0.06 ng/μL）、绵羊（0.06 ng/μL）、山羊（0.06 ng/μL）的基因组标准品和纯化水（阴性对照）进行扩增，结果见表4。各探针针对其特异性基因组模板的扩增结果为阳性，针对其它基因组模板和纯化水的扩增结果均为阴性。

表4 专属性检测结果

5.3 耐用性

利用不同的探针，对各组溶液的Ct值进行耐用性检测，分不同时间段进行检测，结果见表5。

表5 耐用性检测结果

6 结论

本文设计了胃酶种属来源鉴定试验，采用不同原材料的基因组进行了相关测试，并对测试数据进行了分析。试验结果表明对于判断胃酶种属来源提供了支撑，说明了本文实验方法的正确性。因此，本文设计的方法可以在实际应用中进行推广。