橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

卢亚莉 张世鑫 杨署光 田维敏 史敏晶

摘  要：在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中，为获得可靠的基因表达结果，筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料，收集其中的胶乳，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件，综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证，筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b，其中ejf2是最佳内参基因，18S不适合作为本研究的内参基因。

关键词：橡胶树;死皮相关;内参基因;qRT-PCR

中图分类号：S794.1      文献标识码：A

Abstract： In order to obtain reliable gene expression results for TPD-related study of rubber tree， the selection of suita-ble reference genes is very important. In the present study， using the latex from the healthy rubber tree， the third grade tapping panel dryness （TPD） tree and the TPD-recovering tree of ‘Reyan7-33-97 as the experimental materials， the expression stability of 20 candidate reference genes were evaluated by using quantitative real-time PCR （qTR-PCR） and softwares of geNorm， NormFinder and BestKeeper. The results showed that， reference genes eif2、ACT7a and UBC2bwere the top three stable genes in the healthy tree; UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b and ACT7b were all stable genes in the third grade TPD tree; UBC2b、eif2 and ROC3 were stable genes for the TPD-recovering rubber tree. Based on the different stable reference genes， relative expressions of HbDXS1， HbHMGS2 and HbNIN3 genes were analyzed respectively. The results showed that eif2 and UBC2b were a couple of stable reference genes for TPD-related study; the eif2 was the most stable internal reference gene; 18S gene was not suitable as reference gene for qTR-PCR in this study.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; TPD-related; reference genes; qTR-PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.012

橡胶树死皮病，即割面干涸病（tapping panel dryness，TPD），是在橡胶树的割线上出現局部或全部不排胶的症状，在世界各国的植胶园中普遍发生，严重影响天然橡胶产量，缩短橡胶树的经济寿命，给橡胶产业带来严重危害。我国橡胶树死皮病发生情况尤其严重，成为当前天然橡胶产业的主要限制因子之一[1]，因此，探索死皮病的发生机理并寻求解决办法已成为当务之急。利用分子生物学手段，研究橡胶树死皮病发生和康复的分子机理已成为近年来的研究热点，其中，对差异表达基因的筛选则是进行基因功能研究和进行分子调控的基础。

基因表达分析的手段众多，单个RNA的稳态水平可以用不依赖PCR的方法如Northern blotting[2]和原位杂交[3]等来衡量，但这些技术耗时长，RNA用量大，实验难度较大，并且重现性较差。……