结直肠癌中VASP表达及与转移关系研究

党运芝 于娇 赵淑红 金龙 任晓跃 王青

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内发病率位列第三，死亡率位列第三［1］。手术切除是CRC最有效的治疗方式，但是复发和转移仍是手术治疗失败的主要原因［2］。另外，约20%的结直肠癌患者在诊断时已出现了转移［3］。尽管近年来CRC治疗方法取得了显著进步，但转移性CRC可选择的有效治疗方式仍较少［4-5］，目前关于CRC转移的机制仍不清楚，亟待进一步研究。VASP是Ena/VASP家族的一个重要成员，可调节actin细胞骨架运动及细胞迁移［6-8］。过表达的VASP可促进多种肿瘤的侵袭和迁移，且与差的预后呈正相关［9-11］。但关于VASP在结直肠癌中的表达和功能报道较少。本研究检测了VASP表达，并分析了VASP表达量与结直肠癌预后的关系。通过体外细胞实验及裸鼠体内实验探索了VASP在CRC转移中的作用。

材料与方法

一、细胞系和人组织标本

人结肠永生化细胞CRL1 790，人结直肠癌细胞系SW480、S1226、DLD-1、RKO、Caco-2、SW620、LoVo、SW48、T84和Colo201引自美国模式菌种细胞库（ATCC），由陕西省人民医院实验室组织细胞库保存。

二、荧光定量PCR

用Takara试剂盒提取新鲜组织的RNA，用Takara试剂盒逆转录成cDNA，后行荧光定量PCR。反应程序如下：95°C，15s；55-60 °C，15s；72°C，15 s共45个循环。用如下公式计算样本的表达量：2–ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCtTumor– ΔCtNontumor）。

VASP的引物序列如下：

正向：5'-ATGGCAACAAGCGATGGCT-3'

反向：5'-CGATGGCACAGTTGATGACCA-3'

三、免疫组化

结肠癌及癌旁组织芯片，65℃烤片3～4 h，常规脱蜡水化，柠檬酸钠（pH=6.0）高压修复2 min，冷却至室温后于3%H2O2封闭15 min。加入VASP（abcam，ab229624）一抗，4℃孵育过夜。第二天PBS漂洗3次×5 min后，滴加二抗，室温孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min后，滴加辣根过氧化物酶，室温孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min，DAB显色，脱水透明，中性树脂封片。

免疫组化评分由两位病理科医生独立完成，免疫染色强度分为0～3分：0（阴性），1（弱阳性），2（中度阳性），3（强阳性）。……