乳铁蛋白基姜黄素纳米载体颗粒的制备及其对大鼠抗疲劳能力的影响

贾前生，刘远洋

（1.黑龙江八一农垦大学体育教研部，黑龙江大庆 163000；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163000）

长期或高强度的运动、工作是导致机体出现“过度训练综合征”的重要成因，它不但使机体免疫力下降，还会引发食欲不振、精神萎靡、注意力不集中等疲劳症状[1−2]。疲劳的产生机理主要与机体氧化应激水平相关，研究表明过度训练会诱发细胞凋亡并引起脏器运动性损伤，而高氧化应激水平会加速细胞凋亡的进程，因而对机体氧化应激水平的调控是延缓疲劳的重要途径[3−5]。

多酚类天然提取物-姜黄素由于其安全性高、商业用途广泛、具备多种药用活性，使其成为了运动恢复与缓解疲劳类产品开发的重要研究对象[6−8]。研究证实姜黄素所具有的羟基活性基团能够有效阻断自由基的转导通路、从而降低机体的氧化应激水平[9]。在此基础上，通过过度训练大鼠模型,研究发现姜黄素能够减轻骨骼肌的氧化应激损伤降低疲劳性损伤[10]、抑制脏器细胞凋亡从而保护脏器[11]以及降低与自由基产生相关的生化指标水平，进而缓解运动性疲劳[12−13]。

尽管姜黄素在医药领域以及运动恢复产品中极具开发潜力，但姜黄素自身的疏水结构导致其水溶性极差，而人体摄入后会快速将其排除体外，姜黄素极易受到温度、pH的影响并易发生降解，使其生物可利用度大大降低，因而尚未被视为有效的商业治疗剂、营养补充剂[14−16]。为了克服姜黄素口服吸收的障碍，研究人员已尝试使用递送系统将姜黄素包埋[17]，如纳米颗粒载体技术。纳米颗粒载体技术在当今的生物医疗领域已十分成熟，通过该技术不但可以保持姜黄素在存储、运输以及人体消化过程中结构的稳定性，还能使其更易进入小肠上皮细胞被人体所吸收，从而提高其在生物可利用度[18−19]。王玮琛[20]建立了小鼠疲劳模型并发现以玉米蛋白-多糖为载体的姜黄素纳米颗粒具有良好的生物利用率，并能够修复由疲劳引起的氧化应激损伤。目前国内外大部分研究重点在于姜黄素单体的抗氧化以及体外作用机制的探究，姜黄素纳米载体相关方面的研究局限于生物可利用度的提高，纳米载体技术大多处于制备优化工艺阶段；而对于姜黄素通过传递体系后在机体内相关生物学活性以及物质间协同作用的研究较少，对于姜黄素纳米载体颗粒体内抗疲劳活性的研究也尚有较大拓展空间。

因而本实验拟以乳铁蛋白为载体建立姜黄素纳米载体颗粒，通过体内消化吸收实验以及运动性疲劳模型，以力竭运动时长、血乳酸、肌糖原、肝糖原以及体内相关抗氧化酶等参数对该纳米载体颗粒的抗氧化性、抗疲劳活性进行综合评判，以期为后续姜黄素纳米载体颗粒在抗疲劳营养补充剂的相关研究中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

UV-2600 紫外可见分光光度计 日本岛津公司；1260 型高效液相色谱 安捷伦科技（中国）有限公司；FC酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；MYP11-2A恒温磁力搅拌器 德国IKA公司；H1850 台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Zetasizer Nano ZS粒度分析仪 英国马尔文仪器；TCS SP2 激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM）德国Leica公司；Morris恒温水池 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素纳米载体的制备 乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒的制备，参考江萍[21]的方法稍作修改，配制质量浓度为1 mg/mL的姜黄素无水乙醇溶液并于超声浴（25 ℃，80 W）中超声2 h使姜黄素充分溶解；配制质量浓度为1 mg/mL的乳铁蛋白Tris-HCl缓冲液（pH=7.5），将一体积姜黄素溶液快速导入五体积乳铁蛋白溶液中，于4 ℃静置12 h后用0.22 μm的PES水系滤膜除去未被包埋的姜黄素，将滤液冻干后得到天然乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒。

1.2.2 姜黄素的检测方法 姜黄素的HPLC检测参考张聪聪[22]的方法稍加修改，进样体积10 μL，流动相A为甲醇溶液，流动相B为5%的乙酸水溶液，流动相比例为85:15，等度洗脱流速0.5 mL/min；柱温箱温度30 ℃，检测波长425 nm，洗脱时间15 min。标准品溶液浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL，以将大黄素为内标，以姜黄素峰面积与内标大黄素峰面积之比为Y轴，以姜黄素浓度为X轴作图。

1.2.3 负载率和包封率的测定 负载率[21]：称取一定量纳米载体颗粒溶解于甲醇中，磁力搅拌2 h后，在4000 r/min条件下离心分离30 min取上层清液；包封率：称取一定量纳米载体颗粒溶解于蒸馏水中，在8000 r/min条件下离心30 min，取上层清液进行测定（方法如1.2.2），姜黄素的负载率和包封率按如下公式计算：

式中：M清为上清液中姜黄素的总质量，M姜为载体颗粒中姜黄素的总质量，M总为纳米载体颗粒的总质量。

1.2.4 姜黄素纳米载体的结构表征

1.2.4.1 粒径分析 分别将天然乳铁蛋白以及天然乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒复溶于纯净水溶液中，配制成蛋白浓度约为0.2 mg/mL的溶液，持续搅拌30 min确保充分混匀后，在室温下使用粒度分析仪进行分析，系统平衡时间120 s，每组样品扫描次数12 次。

1.2.4.2 激光共聚焦 根据Wang[20]的方法稍加修改，用异丙醇配置浓度为0.1%(m/v)的尼罗蓝染液。将乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒复溶液稀释后，取10 mL样品溶液于试管中，用移液枪准确加入400 μL尼罗蓝后充分振荡混匀，并用锡纸包裹避光染色30 min。染色结束后取1 μL溶液于载玻片上，在20 倍物镜视野下手动调焦并进行成像并观测样品显微结构。

构建快筛快检研发应用体系，提高市场打假效能。广东省所为落实监管新要求，不断在快筛快检技术上发力，建立非法添加数据库410种、产品数据库360种，非法添加快筛方法30多种，申请发明专利45项，已被授权31项。其中25项实现了产品化，涵盖药品、保健食品、化妆品和食品领域，基本覆盖市场上常见非法添加药物。2012年,西布曲明快筛方法获省科学技术三等奖。2013年,《食品药品中非法添加化学成分的监督检验系统技术策略及其应用》获省科学技术二等奖。2014年，全国药检系统中首个非法添加快检技术系统研究平台启动。同时，该所通过举办培训班、开展竞赛等形式，推广了快筛快检技术在基层一线的应用。

1.2.5 动物实验

1.2.5.1 姜黄素纳米载体颗粒的体内吸收 选取健康SD种大鼠20 只随机分为2 组，自由采食饮水，给予样品前12 h禁食不禁水。分别给予姜黄素含量为100 mg/kg·bw·d的姜黄素纳米载体颗粒和姜黄素溶液，并于灌胃后第0、15、30、45、60、90、120、180、240、300 min尾部采血0.3 mL，置入含有肝素的抗凝管中。

在血浆姜黄素的测定时，取100 μL血浆样本加入10 μL大黄素（20 μg/mL），涡旋3 min后加入0.25 mL乙酸乙酯并剧烈振荡摇匀，在4000 r/min条件下离心5 min，取上层有机相用以姜黄素的测定，测定方法见1.2.2。

1.2.5.2 运动性疲劳实验 动物实验模型参考胡戈[23]稍加修改，选取健康大鼠60 只随机分为5 组，即对照组（Blank）、疲劳模型组（Con）、疲劳低剂量组Low（20 mg/kg·bw·d）、疲劳中剂量组Mid（60 mg/kg·bw·d）和疲劳高剂量组High（100 mg/kg·bw·d）。除对照组外，四组疲劳组于第1 周无负重游泳至力竭，于第2 周鼠尾负重约体重5%、第3、4 周负重10%，水温30 ℃，每周休息1 d并记录体重。总实验周期持续28 d，期间采用灌胃法给予样品，对照组及模型组提供0.9%生理盐水，其余每组按剂量组给予乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒3 mL/d，当大鼠在水中沉没持续10 s后未上浮即为力竭，记录时间计为力竭时长（min）。

1.2.6 肝脏、肌肉以及血清样本的采集 分别于最后一次大鼠游泳前、游泳后0、30、60、90 min鼠尾采血，并置于抗凝管中，1500 r/min条件下离心5 min，后用以测定血乳酸的含量。鼠尾采血结束后立即处死大鼠，眼球取血，并将采集到的新鲜血液于4 ℃静置1 h后，在1500 r/min条件下分离15 min取上层血清，分别用以测定血浆姜黄素水平、血乳酸（LA）、血尿素氮（BUN）含量。解剖后，摘取肱四头肌及肝脏组织，用0.9%NaCl清理后制成10%组织匀浆，分别用以测定肌糖原（MG）、肝糖原（LG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量严格按照试剂盒操作说明测定，剩余血清保存于−70 ℃超低温冰箱中备用。

1.3 数据处理

应用SPSS 19.0 软件对数据进行。实验数据以均值±标准偏差（Mean±SD）表示，多样本间比较采用T-Test，P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。采用Origin 2017 软件进行图表处理及图谱分析处理。

2 结果与分析

2.1 姜黄素的HPLC分析及结构表征

2.1.1 姜黄素的HPLC分析 血浆空白对照组、姜黄素标准品及血浆样本液相色谱图见图1，线性回归方程为Y=0.94X+234.82，R2=0.9963。

图1 姜黄素标品及血浆样本Fig.1 Curcumin standard and plasma samples

2.1.2 姜黄素纳米载体颗粒结构表征 实验通过HPLC法测定姜黄素纳米载体颗粒的负载率为（152.03±2.43）mg/g，包封率约为63.57%±0.74%；乳铁蛋白和姜黄素纳米载体颗粒的水溶液经粒度分析仪测定所得粒径分布图如图2，可以发现乳铁蛋白（图2A）和姜黄素纳米载体颗粒（图2B）的粒径分布均较为均一，乳铁蛋白粒径（163.4 nm）明显低于姜黄素纳米载体颗粒（593.8 nm）。Chen等[24]在制备大豆分离蛋白姜黄素纳米载体时发现，姜黄素负载量较高的纳米颗粒会形成较大粒径分布的颗粒体，与本文结果相符。这可能时由于乳铁蛋白载体颗粒负载了姜黄素后，会通过姜黄素颗粒间的桥连作用，形成了更大粒径的聚集体并能够形成压稳定状态的分散系。此外，通过CLSM（图2C）实验结果也可以发现，姜黄素纳米载体颗粒能够以较为均一稳定的结构在溶液中存在。

图2 粒径分布及CLSMFig.2 Particle size distribution and CLSM

2.1.3 姜黄素纳米载体颗粒的体内吸收 实验通过HPLC对大鼠6 h内姜黄素的血药浓度进行了测定，并绘制了血药浓度与时间的姜黄素动态变化曲线如图3。从图中可以发现，姜黄素能够迅速提升血药浓度并在约30 min后达到峰值，随后血药浓度迅速降低并于60 min后血药浓度趋于平缓，这可能是由于姜黄素水溶性极差，从而影响其直接服用[14]，此外由于首过效应致使姜黄素在消化道灭活、代谢，进入体循环的药量减少[25]；而姜黄素纳米颗粒则需要约50 min使血药浓度达到峰值并能够维持一段时间，随后在4 h内血药浓度缓慢回落，这可能是由于姜黄素纳米载体颗粒能极大提高姜黄素在溶液体系中的浓度，因而血药浓度峰值较姜黄素水溶液高，另一方面纳米载体颗粒对姜黄素起到了保护作用，降低了首过效应，纳米载体的缓释效果也能够使姜黄素在体内得到更充分的吸收、代谢[26]。

图3 姜黄素动态变化Fig.3 Dynamic changes of Curcumin

2.2 动物实验

2.2.1 运动型疲劳实验 通过力竭游泳运动的时长能够较为客观的评判受试样品的抗疲劳功效。在造模后各组大鼠在个体质量上并未出现显著差异（P>0.05），且无死亡样本，但模型组终末体重略低于剂量组。根据表1 数据结果显示，模型组以及三组剂量组大鼠的力竭时长与对照组相比极显著降低（P<0.01），表明运动性疲劳造模成功。与模型组相比，低剂量组未能显著提高力竭运动时长（P>0.05），中、高剂量组能够显著提高力竭运动时长（P<0.05），表明中、高剂量组的姜黄素纳米载体颗粒具有良好的抗运动性疲劳效果，其中高剂量组效果更佳，时长约提高了55.07%。

表1 大鼠体质量与力竭运动时长Table 1 Body weight and duration of exhaustive exercise in rats

2.2.2 乳酸变化曲线 通过对大鼠力竭游泳前后血乳酸含量变化的监测，可以判断大鼠的疲劳程度以及恢复状况[27]，实验结果如图4，数据统计结果显示力竭游泳前运动性疲劳模型下大鼠的血乳酸含量极显著高于对照组（P<0.01），且模型组与剂量组组间差异不显著（P>0.05）。游后0 min，模型组、Low、Mid、High四组大鼠血乳酸分别上升了17.49%、13.32%、8.30%、7.69%；游后30 min，四组大鼠乳酸分别下降了1.35%、1.77%、2.28%、4.45%；60 min后，四组大鼠乳酸分别下降了2.76%、3.56%、4.89%、8.67%；90 min后，四组大鼠乳酸分别下降了3.89%、5.40%、7.14%、13.06%。可以发现，大鼠在给予高剂量后，其体内的血乳酸含量较其他组别升高最少，并且在90 min内血乳酸相对含量下降最快，表明姜黄素纳米颗粒能具有减少乳酸堆积的功效，在运动性疲劳模型下减少乳酸堆积能力与剂量正相关。

图4 血乳酸动态变化Fig.4 Dynamic changes of blood lactic acid

2.3 肌糖原、肝糖原与血尿素氮

机体在运动的过程中会首先消耗肌糖原，为了维持运动强度所需的能量供给会逐渐消耗肝糖原。因而机体肌糖原与肝糖原的水平降低与体力耗尽具有一定相关性，实验结果见表2。在运动性疲劳模型下大鼠的肝糖原均极显著低于对照组（P<0.01），与模型组相比经喂饲纳米颗粒的剂量组大鼠肝糖原均有极显著提升（P<0.01）；与对照组相比,模型组与低剂量组大鼠的肌糖原含量均显著降低（P<0.01，P<0.05），而中、高剂量组大鼠的肌糖原差异不显著（P>0.05），与模型组相比仅高剂量组差异显著（P<0.05）且含量高于模型组；血尿素氮含量的统计结果显示三组剂量组均能够极显著降低血尿素氮含量（P<0.01）。表明姜黄素纳米载体颗粒能够提高肌糖原与肝糖原的储备，并能够缓减体内蛋白质的消耗降低血尿素氮的含量。

表2 肝糖原、肌糖原与血尿素氮Table 2 Liver glycogen,muscle glycogen and blood urea nitrogen

2.4 体内抗氧化活性分析

疲劳症状的出现通常与机体自由基水平升高有着密切联系，通过对血液和组织中抗氧化物酶活性的检测能够较为清晰的反应机体自由基蓄积水平。本实验通过SOD、GSH活性以及MDA含量解析姜黄素纳米载体颗粒的抗氧化活性，数据统计结果见表3。

表3 姜黄素纳米颗粒载体对大鼠生化指标的影响Table 3 Effects of curcumin nanoparticles on biochemical indexes in rats

SOD：经造模的四组疲劳组的SOD酶活性极显著低于对照组（P<0.01），与模型组相比三组剂量组均能够显著（极显著）提高SOD酶的活性(P<0.05、P<0.01)，低、中、高剂量组分别提高了7.72%、11.96%和20.06%。

GSH：模型组的GSH酶活性极显著低于对照组（P<0.01），与对照组相比,低剂量组GSH酶活性极显著降低（P<0.01），而中、高剂量组能够使GSH水平恢复至对照组水平（P>0.05）；与模型组相比,低剂量组能够显著提高GSH酶活性（P<0.05），而中、高剂量组能够极显著提高GSH活性（P<0.01）。

MDA：运动性疲劳模型下的四组大鼠血清中丙二醛的含量极显著高于对照组（P<0.01），经喂饲姜黄素纳米载体颗粒后，三组剂量组均能使机体内丙二醛水平极显著低于模型组（P<0.01），其中高剂量组效果最佳，下降了约30.66%。

3 讨论

姜黄素的亲脂特性致使其在人体消化系统中表现出较差的吸附性，姜黄素结构中的羟基结构极易发生氧化反应而变性[28]，姜黄素得不到有效的吸收，因而生物利用率极低，而通过应用纳米载体颗粒传递体系使该问题得到显著改善。通过包封率和负载率的测定，可以发现姜黄素在溶液体系中的溶解性大大提高；粒径与CLSM的实验数据较好的说明，纳米载体颗粒在溶液体系中能够以稳定、均一的状态分散；通过比对纳米载体颗粒与姜黄素单体溶液的大鼠体内吸收实验发现，纳米载体颗粒溶液首过效应大大降低，并能够在人体内存留更长时间，起到了缓释作用使人体吸收更充分[29]。随后通过力竭游泳建立了运动性疲劳大鼠模型，通过4 周力竭游泳造模后大鼠的终末体质量均有所减少，而在分别饲喂低、中、高剂量组的纳米载体颗粒后发现，与模型组相比三组剂量组均能够不同程度提高耐力运动时长，其中高剂量组提升效果最为明显，表明其抗疲劳效果与剂量相关；通过对力竭运动后大鼠血乳酸动态变化的监测，可以发现，纳米载体颗粒能够有效加速血乳酸代谢水平，一定程度上延缓了由于糖原消耗过导致血乳酸堆积而诱发的肌肉收缩能力下降[30]，表现为增强了大鼠耐力运动时长，此外，肌糖原与肝糖原储备量的提升也能够一定程度延缓血乳酸的堆积[31]，同时降低了长期运动诱使的蛋白质代谢所产生的血尿素氮含量[32]；机体疲劳的产生与氧化应激水平密不可分，在长期或高强度运动的情况下，机体内活性氧自由基的产生会远超越其清除速率致使细胞受到氧化损伤[33]，实验通过对SOD、GSH-Px酶活性的检测，发现姜黄素纳米载体颗粒能够加速活性氧自由基的清除速率从而保护组织和器官免受氧化损伤，并最终表现为过氧化代谢产物MDA含量的显著降低，其抗氧化活性越高其耐力运动时长越长，表明乳铁蛋白-姜黄素纳米载体颗粒具有一定的抗疲劳功效。

4 结论

本实验制备了一种具有较好包封率和负载率的乳铁蛋白姜黄素纳米载体颗粒，该颗粒在水溶液体系中具有良好的稳定性，较姜黄素单体溶液极大的提升了单位体积内姜黄素的溶解度，并通过大鼠体内吸收实验充分佐证了其在机体内也具备良好的缓释作用以及保护作用，一定程度上降低了首过效应并延长了姜黄素在机体内的存留时间，从而间接提升了其生物可利用率；通过运动型疲劳模型可以发现，纳米载体颗粒能够有效提升抗氧化物酶活性、提高机体糖原储备、加速血乳酸代谢从而降低由长期高或强度运动引发的氧化代谢产物堆积、降低机体氧化应激水平、减轻氧化损伤，并最终表现为大鼠力竭耐力运动时长的提升，表明其具有一定的抗疲劳功效。

综上，乳铁蛋白姜黄素纳米载体颗粒传递体系能够有效提升姜黄素的生物可利用率，从而保障了其充分发挥抗疲劳活性，以期为姜黄素类相关抗疲劳制品提供理论参考。