季铵盐改性止血海绵的制备及其生物性能研究*

李红梅，张素文，罗西友，尹弢，郈秀菊

(山东省药学科学院 山东省医用高分子材料重点实验室，济南 250101)

1 引 言

外科手术中快速有效地控制出血，降低创伤，防止细菌感染具有重要意义。传统止血材料种类较多，但均存在一定的缺点，如对伤口处组织的粘附性差，不控制出血可能会导致严重的并发症,并增加患者的死亡率，止血时间相对较长，可能会导致二次出血，容易产生病毒感染和保存期限较短等。

近年来，生物医用材料的研究取得了很大进步，同时也加快了接触止血材料的发展[1-4]。目前临床应用的接触止血材料主要为可吸收性止血材料[5-7]，包括以下几种：

(1)可吸收性明胶海绵、胶原蛋白海绵、微纤维胶原蛋白粉[8-11]：它们来源于动物组织提取物，含异种蛋白，易引起过敏反应和发热症状，人体吸收在4周以上，期间会增加感染率，影响伤口愈合，临床局限性大。

(2)改性纤维素止血纱布：代表产品为强生公司的速即纱TM(SURGICEL)。正常的人体组织因缺乏代谢纤维素的酶导致吸收速度相对较慢，且产品呈酸性，临床上可能引起局部的感染及影响局部组织愈合。

(3)微孔止血球[12]：代表产品有美国的AristaTM和山东赛克赛斯药业科技有限公司的“瞬时”复合微孔多聚糖止血粉。生物相容性好，无过敏反应，不会感染动物源性疾病。但活动性出血时难附着。

鉴于此，本研究旨在开发一种快速止血兼具生物相容性和抗菌功能的安全[13-18]、有效的植物多糖手术止血材料。

2 材料和方法

2.1 原料试剂

季铵盐改性淀粉聚合物(季铵盐和淀粉的质量摩尔比为0.3∶1时的反应产物，其中季铵盐是由环氧氯丙烷和N,N-二甲基辛基叔胺合成所得)，北京化工大学；甘油、聚山梨酸酯60，分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

2.2 仪器设备

集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101S型，上海雷磁仪器厂；冷冻干燥机，FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司。

2.3 实验方法

取季铵盐改性淀粉聚合物8.0 g，甘油3.0 g，蒸馏水88 g，55℃水浴加热溶解4 h，然后加入聚山梨酸酯601 g。物理发泡后经低温冷冻干燥，得季铵盐改性止血海绵。

2.4 吸水倍率测试

称取季铵盐改性止血海绵0.8 g[19]，置于洁净干燥的培养皿中，称重m1，加入适量去离子水，待海绵吸水饱和后，倒出多余水分，称重m2，根据式(1)计算吸水倍率(A)：

A= (m2-m1)/0.8

(1)

2.5 吸水速率测试

称取季铵盐改性止血海绵0.2 g，加入水，开始计时，到样品完全吸水停止计时，记录时间(s)。

3 结果与讨论

3.1 配方工艺研究[20-24]

按照季铵盐改性淀粉聚合物和甘油的质量比分别为8∶1、8∶3、8∶5混合，加适量水，55℃水浴加热溶解4 h，然后按照季铵盐改性淀粉聚合物和聚山梨酸酯60的质量比分别为8∶0.3、8∶0.5、8∶1、8∶1.2的比例加入聚山梨酸酯60，物理发泡后经低温冷冻干燥，制得季铵盐改性止血海绵，测试不同配方的吸水倍率和吸水速率，结果见表1，最优配方为季铵盐改性淀粉聚合物∶甘油∶聚山梨酸酯60=8∶3∶1。

表1 季铵盐改性止血海绵的吸水倍率和吸水速率Table 1 Water absorption ratio and water absorption rate of sponge

3.2 冷冻干燥成型工艺研究

季铵盐改性淀粉止血海绵的冷冻干燥工艺中，冷冻温度分别选择-20℃、-38℃、-56℃和-66℃，冷冻时间分别选择8、12、20、24 h，冷冻干燥结束后观察海绵的状态并测试其吸水倍率，结果见表2。冷冻干燥的最优工艺为冷冻温度-56℃、冷冻时间20 h。

表2 冷冻条件对海绵性能的影响

3.3 抑菌性试验[25]研究

根据季铵盐和淀粉的不同质量摩尔比所得的醚化产物(北京化工大学提供)进行常温和加速3月的抑菌性研究，按照GB 15979-2002 中附录C4的方法进行。筛选出抑菌性良好的工艺条件，结果见表3。当季铵盐和淀粉的质量摩尔比大于0.3∶1时，其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的常温和加速3月的样品抑菌率大于90%，说明抑菌率及稳定性良好。

表3 抑菌性研究

3.4 季铵盐改性止血海绵的大鼠肝脏止血试验[26-27]和体内降解试验

将大鼠按性别、体重随机分为2组，分别为季铵盐改性止血海绵组、胶原蛋白海绵组，每组10只大鼠，将大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠约40 mg/kg，麻醉后仰卧固定，逐层开腹，游离并暴露肝脏左叶，用组织钳在肝脏左叶中间位置切取下一块肝组织(5×3×2 mm)，造成敞开型伤口，自由出血5 s后，使用相应的止血海绵，记录时间，同时用10 g砝码压20 s，取下观察30 s，记录止血时间。手术中，使用称重的无菌纱布收集用药后所出的血液，计算术中总的出血量和止血时间，见表4。术后2、4周，分别将5只大鼠(雌雄均有)麻醉剖腹，观察各大鼠创面的血肿、腹腔粘连和季铵盐改性止血海绵的降解情况并拍照记录。

表4 大鼠肝脏止血实验结果

由表4可知，本研究制备的季铵盐改性止血海绵是一种快速有效的止血敷料。

同时观察得知，2周植入处含未降解的均质淡染的样品，组织未见坏死、水肿、炎细胞浸润等组织病理学变化。刚果红染色结果显示，4周后植入部位无残存的季铵盐改性止血材料碎片，4周后的组织切片见图1。

图1 组织切片图

3.5 细胞毒性试验

细胞毒性试验[28-29]是用体外细胞培养方法进行毒理学风险评价。实验共设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组与实验组，分别放于培养着L929小鼠成纤维细胞的细胞培养板孔内，在5%CO2、37℃细胞培养箱中培养，分别于24 h和48 h后显微镜下观察实验组、阴性对照组、阳性对照组及空白对照组培养后的细胞形态学改变，48 h后用MTT法测定各供试品组(样品组、阴性对照组、阳性对照组)相对于空白对照组的细胞相对增殖率。

结果表明，在本试验条件下，基于MTT定量检测法，未改性淀粉海绵的细胞相对增殖率为83%，细胞毒性分级为1级；季铵盐改性淀粉止血海绵的细胞相对增殖率为200%，细胞毒性分级为4级。说明季铵盐改性淀粉止血海绵有抑菌性，这也与其抑菌性能试验结果相对应。

3.6 皮内刺激试验报告

采用家兔进行皮内反应试验[30]，以评价试验样品在试验条件下产生剌激反应的潜能。采用0.9%氯化钠注射液(SC)和棉籽油(CSO)对试验样品进行浸提，并同理制备不加试验样品的空白对照液。在家兔脊椎两侧皮内注射试验液及空白对照液，于注射后(24±2)、(48±2)、(72±2) h，对注射部位红斑和水肿进行评分，并计算试验样品和对应空白对照的皮内反应最终记分。

结果显示，在本试验条件下，季铵盐改性淀粉止血海绵经浸提后的试验液在家兔皮内反应最终记分均不大于1.0，符合试验要求。

3.7 皮肤致敏试验报告

对试验样品的0.9%氯化钠注射液(SC)和棉籽油(CSO)试验液进行了皮肤致敏[17]最大剂量试验，以评价试验样品在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的潜能。按Magnusson和Kligman分级标准进行描述并分级。对照组动物同法操作。

结果显示，在本试验条件下，季铵盐改性淀粉止血海绵经浸提后的试验液未导致豚鼠出现皮肤致敏反应。

4 结论

本研究选用季铵盐改性淀粉聚合物为原料，进行止血海绵的制备，季铵化修饰可以破坏细菌的细胞质膜，赋予了淀粉抗菌的性能，加速伤口血小板和红细胞的聚集，快速止血。季铵盐改性淀粉止血海绵工艺中最优配方为季铵盐改性淀粉聚合物：甘油：聚山梨酸酯60=8∶3∶1。其冷冻干燥的最佳工艺为冷冻温度为-56℃，冷冻时间为20 h。其中季铵盐和淀粉的质量摩尔比为0.3∶1及以上时(由北京化工大学提供)，其对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑菌率分别达99.98%以上和99.97%以上，抑菌性良好，且生物相容性好。大鼠止血试验以及体内降解试验表明季铵盐改性止血海绵具有良好的止血性能，降解时间能够满足临床上对于止血海绵的性能要求。综上，本研究制备的季铵盐改性止血海绵具有很好的临床应用前景。