基于Smad通路研究软肝丸对TGF－β1诱导的肝星状细胞的影响*

吕莹，郝尧坤，张照兰

河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

肝纤维化是由慢性肝损伤引起的病理状态。慢性肝炎、胆汁淤积、酒精或药物刺激均可引起肝损伤，并进一步激活肝损伤修复过程，引起肝纤维化，进而可发展为肝硬化，最终诱发肝癌发生［1－2］。软肝丸是鳖甲、龟板、穿山甲、当归、生牡蛎、桃仁、鸡内金、甘草等组成的复方制剂。研究表明，软肝丸可有效地促进肝纤维化逆转、改善门脉高压进而延缓肝硬化发展［3］。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肝纤维化进展的关键因素，肝损伤可诱导HSCs增殖、活化并分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）［4］。转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）是活化的HSCs分泌的成纤维细胞因子，其可诱导HSCs分化为成肌纤维细胞促进肝纤维化形成［5］。研究发现，软肝颗粒对肝纤维化大鼠TGF－β1／Smads通路具有调控作用［6］，但作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究通过体外细胞实验探讨软肝丸含药血清对TGF－β1诱导人HSCs LX－2增殖、凋亡、纤维化及Smad通路相关蛋白表达的影响，进一步揭示其抗肝纤维化的潜在分子机制。

1 材料

1.1 动物与细胞SD雄性大鼠，体质量（260±20）g，购于上海凯学生物科技有限公司，合格证号：SYXK（沪）2015－0016。人HSCs系LX－2购于武汉普诺赛生命科技公司。

1.2 药物与试剂软肝丸由鳖甲、龟板、穿山甲、当归、生牡蛎、桃仁、鸡内金、甘草等组成，批号：豫药制字Z20120712（郑），专利号：ZL201310443782.1）。TGF－β1（美国Sigma公司，货号：GF346）；细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK－8）、膜联蛋白V（Annexin V）－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染法凋亡检测试剂盒（北京索莱宝生化公司，货号分别为：CA1210、CA1020－20）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司，货号：11684817910）；总RNA快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM（大连Takara公司，货号分别为：9108／9109、RR047A、DRR820A）；……