馥感啉口服液对屋尘螨诱发的幼龄大鼠哮喘模型的影响∗

张文强 黄涌澜 杨 威 陈文培 代彩玲 李小英 向飞军△ 郭健敏△

（1.广东莱恩医药研究院有限公司，广东省药物非临床评价研究企业重点实验室，国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心，广东省创新药物评价与研究工程技术研究中心，广东 广州 510990；2.广州一品红制药有限公司，广东 广州 510760）

哮喘又名支气管哮喘，是一种由复杂细胞组分及因子共同参与的常见多发性疾病，多以肺部可逆性气流阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征，为临床上儿科最常见的慢性呼吸系统疾病［1］。馥感啉口服液主要由鬼针草、野菊花、西洋参、黄芪、板蓝根等组成，具有清热解毒、止咳平喘、益气疏表的作用，多用于小儿气虚感冒所引起的发热、咳嗽、气喘、咽喉肿痛。有研究报道馥感啉口服液还具有解热、抗炎、镇咳、平喘、耐寒、抗炎及体外抑菌作用［2］。本研究旨在通过尘螨诱发的幼龄大鼠哮喘模型来考察馥感啉口服液对该哮喘模型的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 48只SPF级SD大鼠，3周龄，雌雄各半，体质量50～80 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物饲养于广东莱恩医药研究院有限公司五楼屏障环境动物房，动物自由摄食、饮水，动物房环境温度控制在20～26℃，相对湿度40%～70%，最小换气次数15次/h，12 h光照/黑暗交替。本研究经广东莱恩医药研究院有限公司动物福利与伦理委员会审核通过。

1.2 实验药物 馥感啉口服液由广州一品红制药有限公司生产，规格30 mL/支，含量1 099 μg/mL，产品批号SY10119001；硫酸特布他林片由阿斯利康制药有限公司生产，规格2.5 mg/片，批号1709089。

1.3 试剂与仪器 屋尘螨变应原制剂（ALK-Abelló A/S公司，批号：B6553），戊巴比妥钠注射液（Alfasan Inte⁃national B.V公司，批号：1709296-02），IgE、His ELISA试剂盒（广州开晨生物科技有限公司，批号：E20200701A）。超声雾化器（日本OMRON，型号NB-150U），振荡式肺功能检测系统（法国SCIREQ，型号FlexiVent），全自动血液体液分析仪（日本SYSMEX，型号XN-1000），酶标分析仪（美国BioTek，型号ELx808），生物显微镜（德国LEICA，型号DM3000）。

1.4 分组与造模 选用适应性观察合格的幼龄大鼠48只，按照体质量和性别采用随机数字表法均衡分为6组，分别为阴性对照组、模型对照组、阳性对照组（予硫酸特布他林片）、馥感啉低、中、高剂量组，每组8只动物，雌雄各半。分组后据文献资料［3-4］及笔者关于过敏性哮喘既往的造模经验建立幼龄大鼠哮喘模型。造模方法：除阴性对照组以PBS溶液致敏和激发外，其余各组大鼠均于分组后腹腔注射屋尘螨变应原制剂（1000 SQ-U/mL，0.1 mL/只），每天注射1次，连续3 d，末次致敏后间隔14 d进行激发，激发方法：动物置于雾化装置中，每天不间断雾化吸入屋尘螨变应原制剂（2000 SQ-U/mL）5 min，连续雾化激发7 d。

1.5 干预方法 幼龄大鼠给药剂量参照《毒理学教程》按体表面积等效剂量法进行折算［5］，设定馥感啉口服液给药剂量分别为5.26、10.53、21.05 g/kg，按体表面积等效剂量法折算，约相当于4岁儿童临床拟定用量（40 g/d，以市售样品生药浓度计）的1、2、4倍。设定阳性对照组（硫酸特布他林片）的给药剂量为0.72 mg/kg，按体表面积等效剂量法折算，约相当于4岁儿童临床用量（2.73 mg/d）的2倍。各组动物均于激发第1天开始灌胃给药，给药体积为10 mL/kg，每天1次，连续7d，阴性对照组、模型对照组均给予等体积的纯水，阳性对照组于前4 d给予等体积的纯水，后3d给予硫酸特布他林药液。

1.6 标本采集与检测 各组大鼠均于末次激发后，采用1.5%戊巴比妥钠注射液（50 mg/kg）尾静脉注射麻醉，然后行颈部正中气管切开并插管，测定呼吸系统阻力（Rrs）、呼吸系统顺应性（Crs）及呼吸系统弹性（Ers）。测定结束后采用腹主动脉采血法将动物安乐死，取全血测定白细胞总数，剩余血液不抗凝，分离血清，用于IgE、His表达水平的测定。剖取动物肺脏称取质量计算肺脏系数，（肺脏系数=肺脏质量/体质量×100%）。然后将各组动物肺脏组织用10%甲醛固定，经脱水、石蜡包埋，切片，常规HE染色后，光镜下观察各组动物的肺脏组织病理学变化。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺功能指标检测结果比较 见表1。与阴性对照组相比，模型对照组动物Rrs、Ers均显著升高，Crs显著降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）；与模型对照组相比，阳性对照组、馥感啉口服液高剂量组动物Rrs、Ers均显著降低，Crs显著升高（P<0.05或P<0.01）；馥感啉口服液低剂量组动物Crs显著升高，低、中剂量组动物Ers显著降低，Rrs均有降低趋势（P>0.05），中剂量组动物Crs无显著差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠肺功能指标检测结果比较（±s）

表1 各组大鼠肺功能指标检测结果比较（±s）

注：与模型对照组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与阴性对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。1 cmH2O≈0.098 kPa。下同。

组别阴性对照组模型对照组阳性对照组馥感啉低剂量组馥感啉中剂量组馥感啉高剂量组n 8 8 8 8 8 8 Rrs（cmH2O·s/mL）0.1126±0.0020 0.1363±0.0052△0.1104±0.0022*0.1172±0.0015 0.1166±0.0027 0.1119±0.0016*Crs（mL/cmH2O）0.7715±0.0269 0.5554±0.0309△△△0.6927±0.0221*0.6619±0.0293*0.6030±0.0597 0.7107±0.0349**Ers（cmH2O/mL）1.3790±0.0506 1.7912±0.0778△△△1.5026±0.0325**1.5363±0.0832*1.4477±0.0825**1.4821±0.0675**

2.2 各组大鼠肺脏系数比较 见表2。与阴性对照组相比，模型对照组动物肺脏系数显著升高（P<0.05）。与模型对照组相比，阳性对照组、馥感啉口服液中、高剂量组动物肺脏系数显著降低（P<0.05）。馥感啉口服液低剂量组动物肺脏系数有降低趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠肺脏系数比较（±s）

表2 各组大鼠肺脏系数比较（±s）

组别阴性对照组模型对照组阳性对照组馥感啉低剂量组馥感啉中剂量组馥感啉高剂量组8 8 8 8 8 8 287.00±22.00 286.00±21.00 304.00±23.00 294.00±23.00 299.00±26.00 295.00±22.00 1.39±0.08 1.57±0.09 1.44±0.08 1.42±0.06 1.43±0.06 1.41±0.07 0.48±0.01 0.55±0.02△0.48±0.02*0.50±0.03 0.49±0.03*0.49±0.02*n 体质量（g） 肺脏质量（g） 肺脏系数（%）

2.3 各组大鼠白细胞总数比较 见表3。与阴性对照组相比，模型对照组动物白细胞总数显著增多（P<0.05）。与模型对照组相比，馥感啉口服液高剂量组动物白细胞总数显著减少（P<0.05）。阳性对照组、馥感啉口服液低、中剂量组白细胞总数均有降低趋势，组间差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠血液中白细胞总数比较（×109/L±s）

表3 各组大鼠血液中白细胞总数比较（×109/L±s）

组别阴性对照组模型对照组阳性对照组馥感啉低剂量组馥感啉中剂量组馥感啉高剂量组n 8 8 8 8 8 8白细胞总数2.80±0.34 6.22±0.55△△5.15±0.79 5.13±0.55 4.04±0.41 3.66±0.27*

2.4 各组大鼠血清IgE及His表达水平比较 见表4。与阴性对照组相比，模型对照组动物血清中IgE、His表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型对照组相比，馥感啉口服液中、高剂量组IgE、His表达水平均显著降低（P<0.05）；馥感啉口服液低剂量组IgE表达水平有降低趋势，差异不明显（P>0.05），阳性对照组及馥感啉口服液低剂量组His表达水平均无显著差异（P>0.05）。

表4 各组大鼠血清IgE及His表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠血清IgE及His表达水平比较（±s）

组别阴性对照组模型对照组阳性对照组馥感啉低剂量组馥感啉中剂量组馥感啉高剂量组n 8 8 8888 IgE（μg/mL）22.02±0.85 25.02±0.49△△23.93±0.68 23.31±0.47 23.12±0.40*22.95±0.76*His（ng/mL）11.67±0.16 12.54±0.22△△12.12±0.22 12.14±0.24 11.83±0.19*11.91±0.24*

2.5 各组大鼠肺组织病理学检查结果 见图1。阴性对照组动物肺脏各级管腔结构正常，肺泡腔无扩张或缩小，间质支气管/血管无疏松或狭窄，亦未见炎细胞浸润；模型对照组动物肺脏气道壁皱缩、血管周围疏松/水肿、支气管/血管间质炎细胞（以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主）浸润，而阳性对照组、馥感啉口服液低、中、高剂量组动物上述病变均有不同程度的减轻。

图1 各组大鼠肺脏组织病理学变化（HE染色，100倍）

3 讨 论

哮喘发病率逐年增加，病程长且反复，其病因主要包括遗传和促发因素两个方面。哮喘具有明显的家族患病聚集趋势，患者后代患病率高于普通群体后代患病率［6-7］。促发因素包括吸入性、感染类、食物性和药物性抗原等，其中吸入性抗原主要以有机粉尘（如尘螨等）为主，其种类繁多，亦被认为是城镇哮喘发病的主要原因之一［8-9］。馥感啉口服液现有临床适应证主要为清热解毒、止咳平喘、益气解表等，功能主治为小儿气虚感冒所引起的发烧、咳嗽、气喘、咽喉肿痛等。馥感啉口服液组方中的浙贝母、麻黄、前胡具有解表清热、化痰平喘之功效，甘草调和诸药相辅相成，使其功能绵延而不强烈［10］。本研究在馥感啉口服液现有的主治功能基础之上着重探究其平喘之功效，考察了其对幼龄哮喘动物的治疗效果。

有机粉尘性哮喘是过敏性哮喘主要类型之一，但由于有机粉尘类诱喘剂较卵清蛋白（OVA）、花粉及真菌孢子粗浸液等制备困难，因此该类动物模型的制作相对较少［8］。现有研究中多采用屋尘螨粗浸液，其成分较为复杂，很难复制出天然的尘螨致幼龄动物过敏性哮喘模型。本研究采用吸附于氢氧化铝上的屋尘螨变应原制剂对4周龄大鼠进行腹腔注射致敏，间隔2周后进行雾化激发，该诱喘剂致敏、激发后在幼龄动物体内缓慢释放，不断刺激动物发育阶段的呼吸系统，较好地模拟出临床上儿童因长期处于粉尘环境中而导致的过敏性哮喘疾病。有机粉尘性哮喘特点是阻塞性肺功能障碍、黏液分泌过多、气道炎症及轻中度气道重塑，本试验结合哮喘的发病机制［11-12］，采用屋尘螨对动物进行致敏和激发造模。激发期第4～7天，模型组动物陆续出现挠鼻、伸颈缩胸、呼吸急促、站立不稳等症状，上述症状与冯高华老师等研究者采用OVA诱发的支气管哮喘大鼠症状基本相似［13］。模型建立成功后笔者主要从肺功能、免疫应答、炎症、肺水肿、肺组织病理学等几个方面考察馥感啉口服液对幼龄动物哮喘的改善作用。首先采用振荡式肺功能检测系统测定大鼠的肺功能指标，结果显示模型对照组动物呼吸系统阻力及弹性均显著升高，顺应性显著降低，表明模型动物已具有明显的呼吸功能障碍。病理学检查发现模型对照组动物表现出明显的气道壁皱缩，血管周围疏松/水肿。推断上述病理变化为导致模型动物呼吸系统阻力及弹性升高、顺应性下降的主观因素，而馥感啉口服液低、中、高剂量下对动物呼吸系统阻力及弹性的降低均有不同程度的逆转作用，进而导致动物的顺应性升高。综合病理学结果表明，馥感啉口服液可以很好地缓解幼龄哮喘动物的气道壁皱缩，血管周围疏松/水肿，改善幼龄哮喘动物的呼吸功能。

变应原进体内后，经抗原呈递作用，由淋巴细胞的调控作用分泌特异性IgE［14］，IgE黏附于肥大细胞或嗜酸、嗜中性粒细胞之上，从而释放多种过敏介质（如组胺、前列腺素、白三烯等），进而导致哮喘患者气管平滑肌收缩、黏液分泌增加、炎症细胞浸润等，炎症细胞合成并释放出炎性介质及细胞因子，引起气道炎症反应，这种炎症反应一般是反复且长期的过程［15］。本研究结果显示模型对照组动物血液中白细胞总数、血清中IgE、His表达水平及肺脏系数均显著升高，说明模型动物已处于免疫抵抗及炎症反应中，并由炎症反应导致肺部水肿。病理学检查发现模型对照组动物亦表现出明显的支气管/血管间质炎细胞浸润，而馥感啉口服液低、中、高剂量组动物肺脏系数、白细胞总数及IgE、His表达水平均有不同程度的下降，支气管/血管间质炎细胞浸润具有一定的减轻作用。上述结果表明馥感啉口服液对幼龄哮喘动物的气道炎症及水肿具有良好的减轻作用。气道炎症及水肿或气道重塑引起的气道高反应性是哮喘的重要病理生理特征［16］，本团队后续计划通过离体试验进一步探索馥感啉口服液对气道高反应性的作用及可能的作用机制。

综上所述，馥感啉口服液对屋尘螨诱发的幼龄大鼠哮喘具有良好的治疗效果，其能够改善模型动物的呼吸系统功能，减轻气道炎症及水肿。