电针对创伤性脑损伤大鼠GLT-1和细胞凋亡的影响∗

张晓辉 柳依江 杜若桑 崔 海

（首都医科大学，北京 100069）

创伤性脑损伤（TBI）是由外力作用于头部所造成的一种严重创伤，它的发病率和病死率较高［1-2］，给家庭和社会造成很大危害。谷氨酸兴奋性毒性、细胞凋亡等参与到TBI后继发性脑损伤的发生机制中。谷氨酸（GLU）作为中枢神经系统主要的神经兴奋性传递信号，同时也具有神经毒性，当细胞外液GLU浓度过高时会对神经细胞产生毒害作用，引起神经元凋亡。脑内最主要的GLU清除剂是星形胶质细胞表达的兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2），在啮齿动物中称为谷氨酸转运蛋白-1（GLT-1），它可转运细胞外多余的GLU到胶质细胞内，防止GLU蓄积所引起的神经元兴奋性毒性来保护神经元［3］。本实验通过观察TBI大鼠脑组织中GLT-1的表达和细胞凋亡情况来探讨电针对TBI大鼠的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量280～320 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养环境温度为（23±2）℃，光照/黑暗周期为12 h/12 h，自由饮水进食。

1.2 仪器与试剂

精密颅脑损伤撞击器PCI3000（美国Hatteras in⁃struments公司），68025型脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命技术有限公司），动物组织RNA提取试剂盒（DP431）、TIANScriptⅡRT Kit（KR107-02）、定量试剂盒 SuperReal PreMix Plus（SYBR GreenFP205-02）均购自天根生化科技有限公司、华佗牌一次性无菌针灸（0.30mm×13mm，苏州医疗用品厂有限公司）。

1.3 模型制备

根据随机数字表将大鼠随机分成4组，假手术组、TBI组、手针组和电针组，每组10只。大鼠禁食12 h后以10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.4 mL/100 g），俯卧位固定于脑立体定位仪，备皮消毒后，在大鼠眼睛后方沿正中线做长约1.5 cm的纵向切口，暴露出前囟。在前囟向右旁开2.5 mm，向后旁开1.5 mm处为圆心，用颅钻钻出直径约6 mm的孔，保持硬脑膜完整。随后应用PCI3000撞击器（打击参数设置为撞击头直径4 mm，打击速度4 m/s，打击深度2 mm，停留时间100 ms）撞击此处造成TBI模型，随后清理创口，将骨瓣还纳于骨窗中，用组织胶水封闭，最后缝合头皮。

1.4 干预方法

手针组在造模后随即固定于自制鼠套内，针刺人中，双侧风池、内关。穴位定位按照《大鼠穴位图谱的研制》［4］取穴，人中在鼻中隔下部向上斜刺约1 mm，捻转10 s后出针；内关直刺约2 mm，风池向后斜刺3 mm，二穴行平补平泻手法后留针15 min，每日1次，共干预7 d。电针组针刺穴位方法同手针组，风池和内关进针后快速捻转1 min后，接华佗牌SDZ-V型电子针疗仪，正极在风池穴，负极在同侧内关穴，电针参数采用连续波，频率为2 Hz，电流强度以大鼠肢体轻微抖动为度，留针15 min，每日1次，共干预7 d。假手术组仅打开骨窗，不予撞击，TBI组造模后不进行干预，两组大鼠均被抓取并固定于自制鼠套内15 min，每日1次，共干预7 d。

1.5 神经功能缺损评分（mNSS）

在干预的第2、4、7天使用改良大鼠神经功能缺损评分量表（mNSS）进行神经功能评分［5］，包括运动、感觉、平衡、反射实验和异常体征，总分18分，分值越高，提示神经功能损伤越严重。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 HE染色观察炎性细胞浸润 第7天干预结束后，每组随机选取5只大鼠麻醉，快速开胸暴露心脏，迅速经左心室-升动脉插管，相继灌注生理盐水和4%多聚甲醛后断头取脑，将大鼠全脑标本置于4%多聚甲醛中固定48 h。以损伤部位为中心，切取厚约4 mm左右的标本，进行石蜡包埋。切取合适部位约1 cm，用4%多聚甲醛固定24 h以上。经漂洗、脱水、透明、浸泡等步骤处理后，切成5 μm厚的切片。再烤干、脱蜡、浸水等步骤处理后，用苏木素和伊红分别染色。染色结束后，经75%、85%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片，光学显微镜（20倍）下观察炎性细胞浸润情况。

1.6.2 TUNEL法观察细胞凋亡 上述灌注、固定脑组织后，在打击周围切取约1 cm脑组织，切片常规脱蜡入水后予以内源性过氧化物酶，然后标本片依次加缓冲液、封闭液、抗体稀释液。最后DAB显色，予以甘油封片，在光学显微镜（40倍）下观察阳性细胞数，染色阳性细胞为棕黄色或深棕褐色。

1.6.3 实时荧光定量PCR 将每组剩余的5只大鼠麻醉后，断头取脑，置于冰上迅速分离缺损周围脑组织，根据试剂盒说明书提取RNA，设计和合成引物（见表1），反转录cDNA，用BIOER PCR仪扩增，采用2-ΔΔCT方法进行数据的相对定量分析，对基因的mRNA含量进行分析。

表1 目的基因引物序列

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较

见表2。在第2天，TBI组、手针组、电针组mNSS评分均高于假手术组，且TBI组与假手术组相比有统计学差异（P<0.01），说明造模成功。在第4天和第7天，手针组和电针组评分虽都降低，但电针组比TBI组减少更为显著（P<0.01），说明电针的疗效优于手针组。

表2 各组大鼠不同时间神经功能缺损评分比较（分±s）

表2 各组大鼠不同时间神经功能缺损评分比较（分±s）

注：与假手术组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与 TBI组比较，#P<0.05，##P<0.01。下同。

组别假手术组TBI组手针组电针组n 5 5 5 5第2天0 15.50±1.38**12.50±1.05 12.17±0.75第4天0 15.50±1.05**7.50±1.05*3.17±0.98##第7天0 15.33±0.52**5.33±1.21*2.00±0.89##

2.2 各组大鼠脑组织炎性细胞数比较

见表3，图1。与假手术组相比，TBI组和手针组炎性细胞数量升高且有统计学差异（P<0.01或P<0.05）；与TBI组相比，电针组炎性细胞数量显著降低（P<0.05）。

图1 各组大鼠脑组织炎性浸润情况（HE染色，20倍）

表3 各组大鼠炎性细胞和凋亡细胞数比较（个/mm2±s）

表3 各组大鼠炎性细胞和凋亡细胞数比较（个/mm2±s）

组别假手术组TBI组手针组电针组n 5 5 5 5炎性细胞数7.00±1.23 50.16±4.07**22.12±0.66*11.80±1.10#凋亡细胞数2.27±0.89 24.60±0.98**16.13±1.07*8.87±0.89#

2.3 各组大鼠脑组织细胞凋亡比较

见表3，图2。与假手术组相比，TBI组和手针组凋亡细胞数目增多且有统计学差异（P<0.01或P<0.05）；与TBI组相比，电针组炎性细胞数量明显减少，且有统计学意义（P<0.05）。

图2 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况（DAB显色，40倍）

2.4 各组大鼠脑组织GLT-1 mRNA含量比较

见表4。与假手术组相比，TBI组GLT-1 mRNA含量明显降低（P<0.05），电针组含量明显升高（P<0.01）；与TBI组比较，电针组和手针组GLT-1 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；电针组的GLT-1 mRNA的表达量显著高于手针组（P<0.01）。

表4 各组大鼠脑组织GLT-1 mRNA表达水平比较±s）

表4 各组大鼠脑组织GLT-1 mRNA表达水平比较±s）

注：与手针组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别假手术组TBI组手针组电针组GLT-1 mRNA 1.00±0.00 0.63±0.20*0.99±0.16#2.09±0.11**##△△n 5 5 5 5

3 讨 论

TBI分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤因难以治疗，故目前研究主要集中于继发性损伤。继发性损伤是在原发性损伤基础上经过一系列病理生理过程，包括谷氨酸兴奋性毒性、炎性反应、氧化应激等反应［6］，导致神经细胞进一步损伤。

TBI属于中医学中“头部内伤病”［7］，病因病机最早记载于《灵枢》“若有所坠堕，恶血留内而不去”。陈实功所著《外科正宗·卷之四》中记载“如从高坠堕而未经损破皮肉者，必有瘀血流注脏腑，人必昏沉不省”。历代医家认为TBI病机为脑部受损，瘀血内停，气机受阻，阻滞经络。对TBI大鼠干预的腧穴配伍选择基于颅脑损伤中医诊疗方案和文献检索统计［8］而确定为人中、风池、内关3穴，该方案结合了国家中医药管理局颅脑损伤协作组专家经验，经4轮专家意见征询及修改完成［9］。人中属督脉，督脉“入属于脑”，作为急救要穴，可醒脑开窍；风池位于头颈部，亦可醒脑开窍，疏经通络；内关属心包经，可调理心气，促进气血运行。针刺治疗可发挥开窍醒神，行气活血化瘀，疏通经络的作用。课题组前期研究表明分别在术后6 h、1 d、3 d、5 d针刺相同穴位发现针刺可显著降低胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、S-100B的蛋白水平和改善TBI后神经功能损伤，从而减轻TBI大鼠的脑损伤［10］。研究表明针刺水沟、内关下调缺血脑组织中Caspase-3、聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）蛋白表达，抑制细胞凋亡［11］。

GLU的过度释放是导致继发性脑损伤神经元死亡的重要机制之一。TBI后，GLT-1转运谷氨酸能力受到抑制，大量GLU不能被及时清除，使脑内谷氨酸浓度明显升高，激活NMDA受体，导致Na+、Ca2+等离子通道通透性增加，大量Ca2+进入细胞内，造成细胞内Ca2+超载，引起自由基的大量产生［12-14］，也可以引起神经细胞肿胀，细胞膜损伤，蛋白质水解，最终导致神经细胞死亡［15］。大量实验表明电针可以上调脑缺血损伤部位EAAT2蛋白的表达，降低CA1区凋亡神经元数目［16-18］。但在TBI中鲜有文献报道。

本实验研究结果表明，TBI组中大鼠GLT-1 mRNA表达显著降低，神经细胞凋亡数量和神经功能评分明显增加，表明TBI诱导并加重了脑损伤程度；手针和电针干预后大鼠GLT-1 mRNA表达显著升高，神经细胞凋亡数量和神经功能评分明显减少，表明针刺可减轻脑损伤程度，而且电针干预效果优于手针。

综上，本实验表明针刺干预可提高TBI模型大鼠GLT-1的表达，抑制谷氨酸兴奋性毒性，降低细胞凋亡、炎性细胞浸润和神经功能评分，减轻脑损伤程度且电针干预效果优于手针。课题组将进一步扩大样本量，选取多个时间节点进行整体趋势观察，并结合多种检测方法进一步研究其机制和电针干预TBI的最优参数。