Rac 3通过MAGEA6/AMPKα途径抑制肺腺癌A549细胞的自噬

杜天宇，肖旭阳

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

肺癌目前是我国最常见的恶性肿瘤，在中国每年肺癌新发病例73.33万人，死亡病例61.02万人，居恶性肿瘤发病率及死亡率的首位[1]。随着人们体检意识增强，肺腺癌的检出率、发病率逐渐提升，因此肺腺癌的发生、发展、耐药等基础研究一直是肿瘤研究中的热点。

Rac 3是一种分子量为21 kd的小分子蛋白，属于Rac家族成员，该家族被认为是细胞骨架的重要调节因子，在神经发育及肿瘤中起到重要作用[2]。Rac 3在肺癌中表达增高，沉默Rac 3后影响肺腺癌A549细胞的侵袭、迁移、上皮间质转化，抑制增殖并促进凋亡[3-5]。自噬是一种高度保守的生物学过程，在肿瘤生存条件恶劣时可以提供必要的养分供细胞生存，而另一方面自噬可诱导凋亡，进而导致肿瘤细胞的死亡。Rac 3能在多种细胞系内引起自噬[6]，但是探讨Rac 3对肺癌自噬影响的研究较少，相关机制仍不明确。

CRISPR/cas9是一种新兴的基因编辑技术，在小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)的作用下可以切断DNA双链，并在基因组受损修复过程中发生移码突变，从而达到敲除基因的效果[7]。本研究使用CRISPR/cas9技术，敲除肺腺癌A549细胞中的Rac 3基因并构建稳定表达的细胞系，并建立Rac 3过表达细胞株，探讨Rac 3对肺腺癌自噬的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和主要试剂

1.1.1 细胞培养：肺腺癌细胞系A549购自中科院细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI-1640，于37 ℃、5% CO2的恒温恒湿培养箱内进行培养。

1.1.2 主要试剂：Addgene购买质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459，Plasmid #48139)，Rac 3抗体够自ABCam，SQSTM-1/p62、AMPKα购自万类生物，LC3、Phospho-AMPKα、ERK 1/2、Phospho-ERK 1/2购自CST，AKT、Phospho-AKT、MAGEA6购自ProteinTech。

1.2 puro-cas9-Rac 3-sgRNA质粒的构建

1.2.1 sgRNA的设……