陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮品质的影响

吴 硕， 邹 璇， 王明亚， 张 庆*

(1.华南农业大学林学与风景园林学院， 广东木本饲料工程技术研究中心， 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室， 广东 广州 510642； 2.河北农业大学动物科技学院， 河北 保定 071001)

陈皮柑(Citrusreticulatacv. Chachiensis)，又称新会柑，被大量用于制作陈皮。新会位于我国南方，属亚热带海洋气候，雨水充沛，气候温暖，适合陈皮柑的种植，由陈皮柑制成的新会陈皮，品质优良，享誉全国[1]。据报道，陈皮柑种植面积逐年增高，年产量高达23万吨[2]。然而，陈皮柑果肉质地差、果核多、易收缩，食用价值低，在制作陈皮时会产生大量的陈皮柑果肉废弃物。废弃的陈皮柑果肉不仅占用空间，而且会滋生细菌、产生腐败的酸臭味，污染环境[3]。但陈皮柑果肉富含有机酸，多酚等活性物质，有研究表明这些活性物质可以抑制有害微生物生长、提高有氧稳定性，防止青贮饲料腐败[4-5]。将陈皮柑汁应用于青贮，可以提高陈皮柑利用率，为陈皮柑果肉废弃物的利用提供新思路。

柱花草(StylosanthesguianensisL.)蛋白质含量高、营养丰富、种植面积逐年增高，是我国华南地区一种重要的牧草；水稻(OryzasativaL.)是一种重要的粮食作物，我国每年产生约2.3亿吨废弃水稻秸秆[6-7]。青贮是一种通过乳酸菌等有益微生物对牧草进行发酵的加工贮藏方式。用青贮手段对柱花草和水稻秸秆进行加工贮藏不仅可以解决我国冬季新鲜牧草供应不足的问题，还能解决废弃秸秆占用空间、直接燃烧造成环境污染的问题，同时提高资源利用率。然而，柱花草可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates，WSC)低，乳酸菌可利用的碳水化合物少[8]，乳酸菌代谢速度慢，产酸少，不良微生物不能被抑制，进而产生有害或无用代谢，造成营养物质的损失，青贮结果较差；水稻是禾本科作物，秸秆中的粗纤维含量高，粗糙坚硬，适口性差，单独青贮不易成功[9]。而陈皮柑汁富含糖类(10.1%～11.3%)、有机酸(如柠檬酸0.7%～0.8%)和多酚等活性物质[10]，可以弥补柱花草和水稻秸秆青贮时缺少可溶性碳水化合物等缺陷，提高青贮品质。陈皮柑汁中的可溶性碳水化合物平均可达到6.20%[11]，能为乳酸菌发酵提供充足的底物，快速降低青贮pH值。其次，柠檬酸是陈皮柑汁中主要的有机酸，有报道称柠檬酸能够有效抑制大肠杆菌等不良微生物[12-13]，陈皮柑汁中的多酚和维生素具有抗氧化性[14]，能够提高青贮饲料的有氧稳定性。除此之外，陈皮柑汁还含有丰富的氨基酸和矿物质，可以提高饲料的营养品质，而且酸甜的陈皮柑汁可以增加饲料的适口性，提高动物的采食率，促进动物生长。

本试验通过在柱花草和水稻秸秆青贮中添加陈皮柑汁，探究陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮品质的影响，以期为废弃陈皮柑果肉的回收利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在华南农业大学实验基地(23.24°14′24″ N，113.64°38′24″ E)种植柱花草和水稻，于2020年11月成熟期，留茬5 cm，用镰刀人工收割柱花草和水稻，用铡刀将材料切成约2 cm的小段，2种材料分别混合均匀备用；将陈皮柑果肉通过物理方法按压，挤出汁液，离心、过滤后，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 试验设计

在新鲜的柱花草和水稻秸秆中分别添加纯水作为对照组(10 mL纯水添加到500 g原料中，CK)；添加1%陈皮柑汁试验组(5 mL纯水+5 mL陈皮柑汁添加到500 g原料中，1%OL组)；添加2%陈皮柑汁试验组(10 mL陈皮柑汁添加到500 g原料中，2%OL组)。样品混合均匀后分别装入聚乙烯塑料包装袋(180 mm × 260 mm)，每袋约180 g，然后用真空密封器(广东省东莞市益健机械包装有限公司)密封，共制作18青贮样品袋(2种原料×3个处理×3个重复)。室温青贮30 d后测定样品的化学成分和青贮指标，并对青贮发酵结果进行统计学分析。

1.3 微生物、有机酸和化学成分测定

1.3.1微生物数量测定 采用平板计数法测定乳酸菌，大肠杆菌，霉菌和酵母菌数量。青贮30 d后，开袋称取10 g样品加入90 mL灭菌生理盐水，充分浸泡5 min后，取1 mL浸取液加入到9 mL的灭菌生理盐水中充分混匀，重复操作将青贮样品中细菌含量逐次稀释至10-6倍，选择适宜的梯度，用MRS琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基和孟加拉红定性培养基在适宜温度的恒温箱中培养乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌48 h，然后计数[15](培养基均来自广东环凯微生物科技有限公司)。

1.3.2pH值及有机酸测定 取10 g样品加入90 mL纯水，混匀后置于4℃冰箱保存24 h，取出后用定性滤纸过滤，用雷磁PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)测定滤液pH值即为青贮样品pH值[16]。然后将滤液用0.22 μm孔径的滤膜进行过滤，用岛津GC-14型高效液相色谱仪(色谱柱：Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本；检测器：SPD-M10AVP)测定乳酸、乙酸、丁酸含量(流动相为3 mmol·L-1高氯酸，流速1 mL·min-1；柱温为50℃；检测波长为210 nm；进样量为5 μL)[17]。

1.3.3化学成分测定 可溶性碳水化合物的测定采用蒽酮比色法：用葡萄糖制作标准曲线，将样品煮沸10 min，冷却过滤定容，经吸取摇匀后加入蒽酮，在620 nm波长下比色测定吸光度，通过标准曲线计算原料中可溶性碳水化合物含量[18]；干物质(Dry Matter，DM)：将柱花草和水稻秸秆青贮样品分别取样称重，放在65℃恒温烘箱烘干至恒重，样品烘干后的质量与烘干前质量的百分比即为干物质含量；氨态氮含量的测定：采用苯酚-次氯酸钠比色法，将(NH4)2SO4烘至绝干后溶于0.1 N盐酸，配置成标准铵溶液，测定吸光度，制作标准曲线，取100 μL样品浸取液，先后加入5 mL苯酚试剂和4 mL次氯酸钠试剂后置于95℃水浴锅中显色反应5 min。待冷却后测定其吸光度，通过标准曲线计算氨态氮含量[19]；粗蛋白质(Crude protein,CP)的测定：称取样品0.5 g，加入适量浓硫酸和催化剂(硫酸钾和硫酸铜按5∶1的比例配置)，420℃消煮2 h，用凯氏定氮仪测定粗蛋白含量；真蛋白(True protein,TP)的测定：称取0.5 g，用50 mL纯水和10 mL三氯乙酸(w/v为15%，TCA)充分浸泡1 h，用定性滤纸过滤，无损失转移残渣，烘干后通过测定粗蛋白的方法测定真蛋白含量；粗蛋白与真蛋白的差值即为非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)含量[15]。

1.4 统计分析

用Excel 2016软件对数据进行初步处理，然后用SPSS 26.0对整理的数据进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮原料的特点

青贮前柱花草和水稻秸秆的化学成份和微生物种群数量如表1所示，柱花草和水稻秸秆干物质含量分别为33.42%，34.59%，粗蛋白含量分别为9.80%和9.40%。水稻秸秆和柱花草可溶性碳水化合物分别为4.77% DM，3.40% DM。原料中微生物数量丰富，柱花草和水稻秸秆表面附着的乳酸菌和大肠杆菌分别为6.41，7.15 log10cfu·g-1FM和6.05，6.51 log10cfu·g-1FM。

表1 青贮原料的特点(±SD，n=3)

2.2 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮品质的影响

由表2可知，与CK相比，试验组柱花草的pH值显著降低(P<0.05)，乳酸含量显著提高(P<0.05)，大肠杆菌数目降低并低于检测值(<2.00 log10cfu·g-1)，酵母菌数量略微提升；试验组水稻秸秆的干物质含量显著提高(P<0.05)，乳酸菌数量显著降低(P<0.05)，大肠杆菌数量降低但差异不显著，霉菌和酵母菌数量都低于2.00 log10cfu·g-1，pH值无显著变化。所有试验组的乙酸和丁酸均无显著变化。

表2 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮品质的影响(30 d,n=3)

2.3 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮营养价值的影响

由表3可知，柱花草青贮试验中，试验组氨态氮的含量显著降低(P<0.05)，2%OL组柱花草真蛋白含量显著升高(P<0.05)，表明2%陈皮柑汁可以提高柱花草青贮过程中蛋白质的保存。水稻秸秆青贮试验中，氨态氮和粗蛋白含量略微降低，但差异不显著。由此可知，陈皮柑汁能有效提高柱花草的青贮发酵品质，而对水稻秸秆蛋白质的保存无明显效果。

表3 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮营养价值的影响(30 d,n=3)

3 讨论

3.1 柱花草和水稻秸秆的特点

一般青贮原料的干物质含量为32%～38%较为适宜[20]，柱花草和水稻秸秆干物质含量为33.42%和34.59%，是较好的青贮原料。原料中柱花草的蛋白质含量为9.80%，远低于王成等[21]报道的15.20%，也小于金莎等[22]报道的11.89%，这可能是受地理环境、土壤肥力和收获季节等因素导致柱花草蛋白质含量不同[23]。青贮原料的可溶性碳水化合物达到60～70 g·kg-1DM时，才能满足乳酸菌快速发酵的需求[24]，而柱花草和水稻秸秆的可溶性碳水化合物含量不高，特别是柱花草，可溶性碳水化合物的含量较低，不能满足乳酸菌快速发酵的需求。因此，添加陈皮柑汁可为乳酸菌提供充足的发酵底物，提高青贮发酵质量。柱花草和水稻秸秆表面附着的乳酸菌数量均大于106cfu·g-1，达到了可以快速发酵的理论要求[25]，但柱花草和水稻秸秆表面的大肠杆菌数量也较多，这可能导致青贮过程中蛋白质的损失和有害物质的产生。

3.2 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮品质的影响

如表2所示，青贮30 d后，试验组柱花草的pH值显著降低，乳酸菌数量和乳酸含量显著提高，这可能是因为陈皮柑汁中可溶性碳水化合物含量高，能够促进乳酸菌繁殖，加速产酸，从而降低柱花草青贮的pH值；试验组柱花草青贮的酵母菌数量略微上升，这可能是在青贮后期，一些耐酸型酵母菌利用陈皮柑汁中残留的碳水化合物生长繁殖的结果[26]。水稻秸秆青贮后，试验组水稻秸秆的干物质显著提升，这可能因为陈皮柑汁抑制了不良微生物的发酵，减少了营养物质的损失；试验组乳酸菌数量(>8.00 log10cfu·g-1)低于对照组，但乳酸含量高于对照组。这可能是因为添加陈皮柑汁的水稻秸秆可溶性碳水化合物含量高，发酵产生的大量的乳酸抑制了一些不耐酸乳酸菌的结果[27]，表2中，水稻秸秆试验组乳酸含量皆为0.67% DM，说明水稻秸秆青贮时，当乳酸含量达到0.67% DM时，可能会抑制乳酸菌自身的繁殖。青贮时，数量较高的大肠杆菌对青贮饲料的保存是不利的，因为大肠杆菌能够和乳酸菌竞争发酵底物，造成营养物质的浪费，而且大肠杆菌代谢会产生无用代谢，甚至毒素影响青贮发酵品质[26]。由表2可知，与对照组相比，在柱花草和水稻秸秆青贮试验中，试验组大肠杆菌的数量皆降低。这可能是因为陈皮柑汁中的柠檬酸、苹果酸等有机酸能够抑制大肠杆菌。据Eswaranandam等人研究，柠檬酸和苹果酸等有机酸能降低微生物细胞内的pH值，改变细胞膜的通透性从而破坏细胞结构，抑制细菌[28-30]。且在有机酸存在的情况下，维生素C可以有效抑制大肠杆菌[31-32]，陈皮柑汁可以作为青贮过程中的大肠杆菌抑制剂。

3.3 添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮营养价值的影响

如表3所示，2%陈皮柑汁能够提高柱花草青贮过程中真蛋白质的保存；而不同添加量的陈皮柑汁对水稻秸秆蛋白质的保存皆无显著影响。青贮饲料中氨态氮的积累主要是植物蛋白酶和微生物对蛋白质综合作用的结果，氨态氮的存在通常作为蛋白质分解标志[33]。本试验中，试验组柱花草氨态氮含量显著降低，水稻秸秆氨态氮也有降低，但不显著。据Pahlow等报道，pH值在5.0～6.0时，梭菌和植物蛋白酶活性较高[34]。而试验组柱花草和水稻秸秆青贮的pH值分别为4.74，4.68和5.16，5.18，柱花草青贮过程中较低的pH值可能抑制了梭菌和植物蛋白酶的活性；而水稻秸秆青贮后的pH值(>5.00)都较高，梭菌和植物蛋白酶没有被抑制导致较多的蛋白质损失，这可能就是试验组和对照组水稻秸秆蛋白质保存效果无明显差异的原因。综上所述，陈皮柑汁可以降低柱花草青贮过程中蛋白质的损失，提高青贮品质，陈皮柑汁在柱花草青贮中有较高的应用价值。

4 结论

添加陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆的青贮品质有一定的改善作用。本研究表明，与对照组相比，添加陈皮柑汁可以提高柱花草青贮乳酸的含量，降低pH值和氨态氮的含量，提高蛋白质的保存率；陈皮柑汁处理的水稻秸秆青贮后干物质含量也显著提升。此外，陈皮柑汁对柱花草和水稻秸秆青贮饲料中的大肠杆菌均有抑制作用。本试验中，陈皮柑汁对柱花草青贮品质影响较大，其中添加2%陈皮柑汁的柱花草青贮品质较好，但最适宜的添加量尚不确定，有待进一步探究。