基于福尔马肼溶液的CRP快速分析仪检测方法

张宜文，赵 旭，王 骏，隗永豪，马 康，吴 红，赵海波

(1. 北京市计量检测科学研究院，北京 100012； 2. 北京市海淀区田村社区卫生服务中心检验科,北京 100143； 3. 中国计量科学研究院，北京 100029)

1 引 言

C-反应蛋白(CRP)快速分析仪是社区基层卫生服务中心的常规仪器之一，是检测相蛋白快速筛选病人病情,排除干扰因素的重要手段。该类型的仪器采用指血直接分析，具有用血量小、全血分析、检测迅速等优势，结合血常规和大型生化分析仪检测结果对病情的初诊和控制具有重要意义[1,2]。目前许多文献对C-反应蛋白在临床检测中的应用进行了研究，发现其在炎症反应、血液病症、心脑系统疾病等方面不仅参与表征病症，并进一步参与了病情的发展[3～5]，在CRP快速分析仪大量应用于临床检测的同时，由于没有相应的国家计量规程或校准规范对该类仪器的量值溯源进行统一，使用单位通常依据自身情况对该类型仪器的量值准确性进行核验，各单位核验和评价的方法项目各异，并且核验结果没有参考范围作为依据[6～9]。

本文通过对CRP快速分析仪的原理和CRP分子结构的讨论，结合JJG 880—2006浊度计国家计量检定规程的项目对CRP快速分析仪进行检测，为这类仪器的定量、定性计量检测分析提供一种方法。

2 实验

2.1 实验原理

2.1.1 免疫浊度透射法和免疫浊度散射法原理

免疫浊度透射法和免疫浊度散射法是基于免疫沉淀的两种方法，其原理为特定蛋白在其相应的抗原-抗体的作用下，结合其对应物形成白色沉淀，通过光学检测其浊度和吸光度/散射光强与溶液粒子浓度成比例的性质，测定抗原-抗体的含量。透射法检测光与入射光夹角为0°，散射法检测器与入射光成(0～90)°夹角。透射法和散射法在对同一样品的测定中相关性良好，均可准确测定浊度值。透射法依据朗伯比尔定律，在浓溶液下不成线性，而在溶液复合物数量较少时的稀溶液中会有本底干扰，散射法在理论上可不受本底的影响[10]。

散射法又分为米氏散射和瑞利散射，在入射波长和待测物直径相似时为米氏散射，入射波长大于待测物直径时为瑞利散射。瑞利散射光强与入射光波长、粒子的大小、折射率和散射角度相关，当入射波长是分子直径的20倍以上时，瑞利散射和米氏散射计算结果相似。米氏散射计算模型可以广泛描述不同尺寸球状粒子的散射特点[11]。在入射光波长以及检测角度固定的情况下，尺寸相似的粒子其散射光强更具可比性。

2.1.2 CRP和福尔马肼溶液性质

C-反应蛋白是Tillet等人在1930年发现的一种非特异性免疫急性相反应蛋白。CRP是五聚体蛋白家族成员之一，相对分子量(Mr115kD)[12]，分子直径(9.76～16.12)nm(见表1)[13]，每个亚基包含206个氨基酸残基(Mr23kD)，5个亚基由非共价键结合形成中空的环状结构，每个亚基的凹面可与Ca2+结合，它的名称(C-reactive protein，CRP)也来源于此。

表1 CRP分子Tab.1 CRP unit cell

目前临床常用的CRP检测方法有免疫浊度透射法、免疫浊度散射法和凝胶散射法等。速率散射法操作简单、检测效率高、成本较低，是CRP快速检测的主要方法。

福尔马肼溶液参照JJG 880—2006浊度计标准物质的配制方法，其分子直径为11.2 nm[14]。

2.2 实验设备及试剂

2.2.1 实验仪器

实验选用临床检测中常见的速率免疫浊度散射法CRP快速分析仪(芬兰Orion公司，Quikreader 101)；仪器配套标准磁卡(芬兰Orion公司)；紫外可见近红外分光光度计(PerkinElmer公司，Lambda950)；浊度计(HACH公司，2100AN)。

2.2.2 实验试剂

C-反应蛋白校准品(水平1～3：9.86 mg/L,20.4 mg/L,55.6 mg/L)；特定蛋白仪质控品(DiaSys,水平1：13.9 mg/L)；CRP缓冲液(Orion，pH7.5～7.7 Tris缓冲液)；纯水机(Millipore，Milli-Q)；零浊度水(离子交换水经过0.2 μm微孔滤膜，反复两次过滤)；福尔马肼浊度标准4 000 NTU(Hach,Cat.246149-CN);福尔马肼溶液系列溶液(0，20，200，400，500，600，700，800，900，1 000，4 000)NTU。

2.3 实验方法和结果

2.3.1 福尔马肼系列溶液吸收光谱测定结果

取配制好的福尔马肼溶液系列溶液(0，20，200，400，500，600，700，800，900，1 000，4 000)NTU摇匀后扫描其在(340～950)nm下的光谱数据，见图1(a)。

图1 福尔马肼溶液吸收光谱图Fig.1 Determination of FormazineSeries Solution by Absorption Spectroscopy

在图1(a)的(650～950)nm波长范围内，福尔马肼浊度溶液(600，700，800，900，1 000)NTU吸光度随着波长增加和浓度增加吸光度数值上升。在朗伯比尔定律的限制条件下，选取吸光度值小于0.7的各点，读取(654，700，800，950)nm波长下吸光度数值，各波长点对吸光度数值作图，线性良好(r≥0.998)，见图1(b)。

2.3.2 浊度计散射测定福尔马肼系列溶液结果

使用零浊度水对浊度计进行调零，并使用浓度为(20，200，1 000，4 000)NTU的系列浊度标准溶液校正仪器后，读取(600，700，800，900，1 000)NTU各点溶液浊度数值3次，取浊度溶液配制浓度对浊度读取数值平均值作图，见图2。

图2 浊度计测定福尔马肼溶液浊度Fig.2 Turbidity Determination of Formaldehyde Solution by Turbidimeter

2.3.3 CRP快速分析仪测定福尔马肼系列溶液线性结果

使用Orion厂家稀释液作为参比，放入Quikreader101中，仪器提示放入样品后，分别加入福尔马肼浊度系列溶液(675，700，725，750，800，900，1 000)NTU，读数并记录显示值，浊度溶液浓度(NTU)对显示值(mg/L)作图，见图3，对应测得数值见表2。

表2 CRP分析仪测定福尔马肼溶液Tab.2 Determination of repeatability of formaldehyde solution by CRP analyzer mg/L

图3 CRP分析仪测定福尔马肼系列溶液Fig.3 Determination ofFormazineSeries Solution by CRP Analyzer

根据式(1)～式(4)计算线性相关系数r=0.999 6。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：x是各个浓度浊度溶液配制值，NTU;y是各个浓度测量值，mg/L;r是线性相关系数。

2.3.4 CRP快速分析仪测定CRP校准品、特定蛋白质控样品及对应的福尔马肼溶液浓度及重复性、稳定性测定

福尔马肼系列溶液(675～1 000)NTU的CRP溶度在(9～40)mg/L之间，购买德赛的CRP校准品水平1～3，对应浓度为(9.89，20.4，55.6)mg/L，水平3用水稀释2倍得到系列CRP溶液为(9.89，20.4，27.8)mg/L。在快速CRP分析仪上测定结果见表3，代入福尔马肼系列溶液曲线，y=0.069 9x-37.844，其中：x为福尔马肼浊度数值，单位NTU;y为CRP快速分析仪读数值，单位mg/L。计算结果为(699，842，928)NTU，配制这个系列浓度的福尔马肼溶液，在快速CRP分析仪上读数，见表3中的b，同时在另一台CRP快速分析仪上进行测试得到表3中的c和d数据。

表3 对比CRP蛋白校准品与福尔马肼溶液Tab.3 Comparing CRP protein calibrator with formaldehyde solution mg/L

使用特定蛋白质控样品，靶值13.9 mg/L，参考范围(10.1～17.7)mg/L，放入Quikreader101中读数显示为13 mg/L。代入福尔马肼系列溶液曲线计算得到结果为727NTU。

配制727NTU的福尔马肼溶液，CRP快速分析仪读数值为13 mg/L，依据式(5)，计算值与实测值相对示值误差0.3%。

(5)

重复性测定结果：取福尔马肼溶液重复测定6次，根据式(6)计算显示值的相对标准偏差(RSD)<0.1%，见表4中第1行。

国有粮食企业改革大致分为三个阶段：（1）在传统计划经济体制下，国家采取政企合一的形式。1985-1992年，初步改革国有粮食企业经营管理体制，取消统购制度，开始实施“双轨制”，自此，政府行为和企业行为逐步分开。（2）1992-2001年，进一步深化国有粮食企业改革。1992年改革统销制度，1994年粮食部门实行“两条线运行”改革，之后国家又实行了一系列旨在解决国有粮企现实问题的政策。（3）2001年至今，全面推进国有粮食企业改革。中共中央、国务院、国家粮食和物资储备局相继发布了一系列加快粮食流通领域改革的文件，旨在推进企业产权制度改革，发挥国有粮食企业主渠道作用。

(6)

稳定性测定结果：每隔5 min测定一次，连续测定6次，共30 min。根据式(6)计算显示值相对标准偏差为2.8%，见表4中第2行。

表4 CRP分析仪测定福尔马肼溶液重复性和稳定性Tab.4 Determination of repeatability of formaldehyde solution by CRP analyzer Repeatability and stability mg/L

3 实验结果与存在问题

3.1 实验结果

3.1.1 透射法测定浊度溶液

在图1(a)中可以看到，在波长数较小的范围内，对于相同的溶液其吸光度数值更高，即可以通过降低波长的方法使透射比增大，从而提高灵敏度。

3.1.2 CRP快速分析仪测定福尔马肼浊度溶液

根据CRM470对于特定蛋白的成人正常参考范围是≤5 mg/L，不同种族、年龄、性别等因素均对CRP水平产生影响。临床实践中，当CRP水平在 10～20 mg/L时可能出现病毒感染，20～100 mg/L时常为细菌感染，≥100 mg/L时排除病毒感染，同时结合血常规、尿常规等对病情的严重程度进行预估。实验选取配制浓度值在(10～30)mg/L之间的CRP校准品，并选用相对靶值浓度较低的特定蛋白质控样品进行比较，是考虑到仪器检测范围在接近下限时，为判断正常值和轻微感染的敏感区，更具有临床价值。根据实验数据，福尔马肼溶液浓度在(700～840)NTU时，对应CRP蛋白浓度为10～20 mg/L。在实际的检测中，还需要配合多种仪器进行确定。

3.2 存在的问题

(1) 配制好的福尔马肼溶液在静置一段时间后出现明显分层，使用前应充分颠倒摇匀。

(2) 经稀释配制后的福尔马肼溶液高浓度(600～1 100)NTU在4 ℃冰箱中保存一周后取出与在室温下放置一周后，重新测定浊度数值未见明显变化。溶液更长时间的稳定性有待考察，如果产生较大变化不利于溶液的使用和量值的稳定性。

(3) 福尔马肼溶液采用的浊度单位NTU与CRP的浓度单位mg/L没有直接的对应关系，通过带入标准曲线的方式反算浓度值，不能确定其真实的浓度值。进一步实验可根据不同浓度的特定蛋白质控或CRM470、C-反应蛋白国家标准物质数值进行核验比对，确定方法的可靠性。

(4) 需进一步对比透射法仪器实验，进行方法可靠性的检验。

4 结 论

本文通过使用CRP快速分析仪对浊度计标准物质福尔马肼系列溶液进行测定，同时参照特定蛋白质控样品通过单点代入法对福尔马肼溶液浊度值和CRP浓度值进行比较，之后使用福尔马肼溶液对CRP快速测定仪的线性、重复性、稳定性进行考察。结果表明，使用福尔马肼系列浊度溶液可部分替代CRP蛋白质控样品的作用，节省昂贵的试剂。

本文提供了一种检测CRP快速测定仪的替代方法，为该类仪器以及相似散射法、透射法原理的仪器提供参考。