PRUNE2点突变影响前列腺癌DU145细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移

曹达龙，朱文恺，施国海，张海梁，王子良，叶定伟

复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

前列腺癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。2021年统计数据显示，前列腺癌位居欧美男性新发恶性肿瘤之首，同时亦是男性恶性肿瘤相关死亡的第二大原因［1］。在中国，前列腺癌的发病率近年来呈快速增长态势［2］。前期研究［3-4］显示，前列腺癌抗原3（prostate cancer antigen 3，PCA3）显著高表达于前列腺癌中并能促进前列腺癌细胞的增殖；鉴于PCA3嵌在PRUNE2基因内含子6中以及它们的转录方向正好相反，我们进一步研究发现，PRUNE2基因受PCA3的负向调控。既往研究［5］证实，PRUNE2还是成神经细胞瘤的一个特异性预后相关基因，在调节成神经细胞瘤的细胞分化、增殖和侵袭方面发挥着重要作用。前期研究［4］还发现，在激素抵抗型前列腺癌患者癌组织中检测到PRUNE2 E370K突变，突变后其表达的蛋白在该位点的氨基酸残基由谷氨酸（E）变成了赖氨酸（K），这可能引起该区域空间结构和功能的剧烈变化，进而调控其下游的信号转导通路变化。本研究拟探索此位点突变对前列腺癌细胞生物学行为的影响，以期发现前列腺癌诊治及预后评估的新靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞系和细胞培养

人前列腺癌DU145细胞系购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。培养基为含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，将DU145细胞置于培养基中于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中进行培养。

1.2 主要试剂

细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本同仁化学研究所，transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，携带野生型和突变型PRUNE2基因的质粒购自上海毅乐生物科技有限公司，凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，PRUNE2抗体（ab80262）、E-cadherin抗体（ab40722）、cyclin D1抗体（ab134175）、Bcl-2抗体（ab692）、FAK抗体（ab131435）、ROCK抗体（ab134181）和RhoA抗体（ab187026）购自英国Abcam公司，β-actin内参抗体购自美国Proteintech公司，兔源和鼠源荧光二抗购自美国Jackson实验室，免疫共沉淀用磁珠购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 包装病毒、细胞转染

选生长状态良好的HEK-293T细胞。将目的质粒10 μg和包装质粒（pRSV-Rev、pMD2.G、pMDLg/pRRE和pCDH-puro）在1.5 mL Ependorf试管中混匀，RPMI-1640培养基定容至 500 μL；在另一个1.5 mL Ependorf试管中加入 25 μL LipofectamineTM2000/LipofectamineTM3000，用RPMI-1640培养基定容至500 μL；将两者混合后加入HEK-293T细胞置于培养皿中，放入培养箱中培养。36～48 h后收取HEK-293T细胞上清液，用0.45 μm过滤器过滤后分装入1.5 mL Ependorf试管中（用于感染目的DU145细胞），-80 ℃保存备用。将待感染的DU145前列腺癌细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁后加入2 mL所收集的慢病毒颗粒至每孔中，继续置于培养箱中培养24 h，然后更换成完全培养基。期间，定期观察细胞状态，等到细胞快要长满时将其接种至 25 cm2的培养瓶中培养。最后，在细胞达到80%丰度时加入嘌呤霉素进行稳转株的筛选。

1.4 CCK-8细胞增殖实验

实验分成两组：一组为PRUNE2野生型（对照组），另一组为PRUNE2突变型（实验组），均设置6个平行孔。按照10000个/孔（100 μL）的密度将实验组和对照组细胞分别接种到96孔板中，然后在培养箱中培养至细胞贴壁，然后分别在第1、2、3、4和5天的同一个时间点，按照10 μL CCK-8检测试剂/100 μL培养基的比例加入CCK-8检测试剂，培养2 h后使用酶标仪检测450 nm波长下的各孔吸光度（D）值。根据所得D值进行比较、作图。实验重复3次。

1.5 细胞克隆形成实验

按照400个/孔的比例将处于对数生长期的实验组和对照组细胞分别铺于6孔板内（每组设置3个平行孔），放置于37 ℃细胞培养箱中培养，共2周。培养过程中每3～4 d观察细胞生长情况，根据细胞生长情况换细胞培养基。克隆数达20～30个时弃上清液，用PBS小心浸洗2遍。随后依次使用4%多聚甲醛1 mL/孔固定30 min，使用0.5%结晶紫在室温下固定0.5 h，PBS洗3遍后在空气中晾干后进行拍照，计算细胞的克隆数目并进行比较。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡实验

取对数生长期的细胞（分为实验组和对照组），使用胰酶消化细胞，离心（每次800×g离心5 min），PBS重悬细胞。用4 ℃预冷的PBS洗2次。加入250 μL 1×结合缓冲液重悬细胞并转移至5 mL流式管中，然后依次加入5 μL Annexin Ⅴ/PE和10 μL 7-AAD，混匀（注意避光），在室温下让其反应15 min。加入400 μL 1×结合缓冲液，混匀后在1 h内上流式细胞仪检测。保存图片，记录早期凋亡和晚期凋亡比例，分析并作图。

1.7 侵袭、迁移实验

细胞侵袭和迁移能力的评价采用transwell小室法。使用无血清培养基按1∶5比例稀释 60 μL的Matrigel基质胶，然后加入到transwell小室上层，放置8 h，备用。实验分成两组：一组为PRUNE2野生型，作为对照组；另一组为PRUNE2突变型，作为实验组，均设置3个平行孔。将稀释于200 μL无血清培养基中的15000个实验组或对照组细胞分别接种在不同transwell小室的上层。然后将它们分别放至在含有750 μL完全培养基的24孔板中，于37 ℃培养箱中培养。2 d后，依次将小室转移到含有4%多聚甲醛的24孔板中固定30 min，以及转移到含0.5%结晶紫的24孔板中固定0.5 h（室温下），再用PBS洗3遍。随后擦去小室的上层细胞，然后在显微镜下进行细胞计数并拍照，实验重复3次。迁移能力的检测：与侵袭能力检测不同的是，transwell小室上层不加Matrigel基质胶，其余步骤相同。实验重复3次。

1.8 蛋白质印迹法（Western blot）检测PRUNE2蛋白及相关蛋白表达情况

PRUNE2是Rho信号转导通路的重要调控因子之一，Rho信号转导通路调节肿瘤细胞侵袭、迁移过程。按照Western blot的标准流程检测PRUNE2蛋白以及与该通路和细胞增殖、侵袭、迁移相关蛋白（E-cadherin、cyclin D1、Bcl-2、FAK、ROCK和RhoA）的水平。

1.9 免疫荧光实验

先将灭菌的圆形盖玻片置入24孔板中，然后每孔铺50000个细胞，分成两组：一组为PRUNE2野生型，作为对照组；另一组为PRUNE2突变型，作为实验组，培养箱内培养过夜。第2天，PBS洗净后每孔加入300 μL 4%多聚甲醛，室温固定30 min。PBS洗净后转移至冰上操作，每孔加入300 μL预冷的含0.1%Triton X-100的1%BSA，室温封闭1.5 h。PBS洗净后每孔加入200 μL不同种属来源的一抗，4 ℃摇床上温育过夜。PBS洗净后每孔加入200 μL按比例稀释的不同种属来源的带有不同荧光标记的二抗，注意避光。PBS洗净后用镊子/针尖小心将盖玻片取出，用吸水纸吸去背面及边缘水分，有细胞附着的面朝下贴在载玻片上，4 ℃温育15 min。随后在激光共聚焦显微镜进行荧光检测，拍照，图片处理。

1.10 免疫共沉淀

培养目标细胞至状态良好，PBS清洗后加入预冷的RIPA缓冲液（已事先加入蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂），用细胞刮子将细胞收集到Ependorf试管中。冰上温育45 min，期间每8～ 10 min振荡器混匀1次，16000×g离心15 min，取上清液（取其中的10～20 μL，用于Input实验）。余下的样品，分成两部分，分别加入含事先用RIPA缓冲液清洗过的磁珠的Ependorf试管中。一管加入10 μL诱饵蛋白抗体（如PRUNE2抗体或RhoA抗体），另一管加入10 μL IgG抗体，做好标记。4 ℃，摇床，温育过夜。各组含样品的Ependorf试管放入磁力架，弃上清液。加入 400 μL预冷的RIPA缓冲液，摇床旋转清洗，5 min，放入磁力架，弃上清液，如此反复清洗5次。加入RIPA缓冲液48 μL重悬，再加入16 μL 4×SDS上样缓冲液，95 ℃煮10 min。冷却，离心（6000×g离心5 min），放入磁力架，收集上清液。使用Western blot检测上述上清液中诱饵蛋白是否与目的蛋白结合。

1.11 统计学处理

该实验所涉及的统计学问题采用IBM SPSS 21.0软件进行处理。本研究中所涉及的组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRUNE2 E370K突变体对DU145细胞增殖和侵袭迁移能力的影响

前期我们在91例激素抵抗型前列腺癌患者癌组织中检测到10例癌组织中存在PRUNE2 E370K突变，即第370位氨基酸残基由酸性氨基酸——谷氨酸（E）变成了碱性氨基酸——赖氨酸（K），这可能引起该区域空间结构和功能的剧烈变化，进而调控其下游的信号转导通路变化。通过慢病毒介导的转染方式，将PRUNE2野生型和PRUNE2 E379K突变型慢病毒质粒导入细胞内，进而观察PRUNE2 E370K突变体对细胞增殖和凋亡能力的影响。CCK-8检测结果发现，在第3～5天时，PRUNE2 E370K突变体组细胞较对照组细胞的生长趋势明显加快，即PRUNE2 E370K突变体能够促进细胞的增殖（P＜0.05，图1A）。随后，利用克隆形成实验进一步发现，PRUNE2 E370K突变体细胞的克隆形成能力也显著高于阴性对照组细胞（P＜0.05，图1B）。同时，利用流式细胞仪检测发现PRUNE2 E370K突变体相较于对照组能够抑制细胞的凋亡（P＜0.05，图1C）。这些结果均表明PRUNE2 E370K突变体能够促进DU145细胞的恶性增殖能力。

通过侵袭和迁移能力的检测，我们发现PRUNE2 E370K突变体细胞的侵袭能力较对照组显著升高（P＜0.05，图1D），PRUNE2 E370K突变体细胞迁移能力亦显著升高（P＜0.05，图1D）。这些结果表明，PRUNE2 E370K突变体与前列腺癌DU145细胞的增殖、侵袭和迁移能力密切相关。

图1 PRUNE2 E370K突变体促进前列癌细胞恶性增殖、侵袭和迁移Fig.1 Mutant-type PRUNE2 E370K promoted malignant proliferation,invasion and migration of prostate cancer cells

2.2 PRUNE2 E370K突变体失去对Rho信号转导通路的抑制，调节下游靶基因的表达

PRUNE2 基因位于9 号染色体，可通过BNIPXL抑制RhoA以及细胞的转化，从而成为Rho信号转导通路的重要调节因子，而Rho信号转导通路又调节肿瘤细胞的侵袭、迁移过程。通过检测PRUNE2野生型和突变型蛋白以及与Rho通路和细胞增殖、侵袭、迁移相关蛋白水平后发现，PRUNE2 E370K突变体促进Rho下游ROCK蛋白和FAK蛋白的表达，以及促进与细胞增殖相关的Bcl-2和cyclin D1蛋白的表达，同时抑制与侵袭、迁移相关抑制蛋白E-cadherin的表达（图2A）。为了进一步验证PRUNE2与Rho通路的关系，通过免疫荧光实验发现，PRUNE2与Rho通路中关键蛋白RhoA之间存在共定位（图2B）。随后，进一步通过免疫共沉淀实验发现PRUNE2与RhoA之间可以相互结合，但是PRUNE2 E370K突变体与RhoA之间的相关作用明显减弱（图2C和2D）。这些结果表明，PRUNE2 E370K突变体蛋白丧失对RhoA蛋白的结合能力，从而失去了对Rho下游信号转导通路的抑制作用，进而促进前列腺癌细胞恶性增殖、侵袭和迁移。

图2 PRUNE2 E370K突变体通过Rho信号转导通路促进前列癌进展Fig.2 Mutant-type PRUNE2 E370K promoted the progression of prostate cancer through Rho signaling pathway

3 讨论

既往的研究发现，PRUNE2是成神经细胞瘤的一个特异性预后基因，在调节成神经细胞瘤的细胞分化、增殖和侵袭方面发挥着重要作用［5］。在前列腺癌领域，有研究［6］发现，PCA3通过ADAR依赖的腺苷到肌苷的RNA编辑机制与PRUNE2形成PRUNE2/PCA3双链RNA调控PRUNE2的表达，以及在前列腺癌细胞中低表达PRUNE2会增强细胞增殖，这表明PRUNE2可能是前列腺癌进展的重要调控因子之一。进一步研究PRUNE2介导前列腺癌进展的机制有助于发现前列腺癌新的诊治靶点。

基因多态性不仅是个体间表型差异的遗传学基础，同时也是个体对常见疾病（如恶性肿瘤）遗传易感性差异的主要来源。近年来，基因多态性，尤其是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），已被用作遗传标记来广泛地研究个体对常见疾病易感性、其对疾病进展的影响以及对治疗的反应［7-8］。已有研究［9］发现，18%的甲状旁腺癌中存在PRUNE2突变。我们前期研究显示，激素抵抗型前列腺癌组织中存在PRUNE2 E370K突变。进一步分析PRUNE2基因的功能区域可知，第370位氨基酸残基由酸性氨基酸——谷氨酸（E）变成了碱性氨基酸——赖氨酸（K），这可能引起该区域空间结构和功能的剧烈变化，进而调控其下游信号转导通路的变化。本研究发现，PRUNE2 E370K突变体相较于对照组能够显著促进细胞增殖、侵袭和迁移以及抑制细胞凋亡。因此，进一步深入研究PRUNE2突变体介导前列腺癌恶性增殖、侵袭、迁移的机制，可以为寻找新的前列腺癌干预靶点提供线索。

由于PRUNE2蛋白拥有BNIP2和Cdc42GAP同源结构域，故其还能通过BNIPXL抑制RhoA以及细胞的转化，从而成为Rho信号转导通路的重要调节因子［10］。隶属于Ras超家族的Rho蛋白又称为Rho GTP酶，尤其是RhoA、Rac1和Cdc42，它们又是调控细胞形态改变、细胞与基质黏附及细胞骨架重组的重要信号转导通路分子，从而调节肿瘤细胞侵袭、迁移的过程［11-14］。同时，有研究［15-16］显示，Rho信号转导通路能够驱动前列腺癌的发生、发展。本研究发现，PRUNE2与Rho通路中关键蛋白RhoA之间存在相互作用，以及相较于PRUNE2野生型PRUNE2 E370K突变体与RhoA之间的相关作用明显减弱。PRUNE2 E370K突变体上调Rho下游ROCK蛋白和FAK蛋白的表达，以及与细胞增殖相关的Bcl-2和cyclin D1蛋白的表达，同时抑制与侵袭、迁移相关抑制蛋白E-cadherin的表达。这些结果表明，PRUNE2 E370K突变体蛋白可能因为与RhoA蛋白结合减弱，从而失去了对Rho信号转导通路的抑制作用，进而促进前列腺癌的发生、发展。