唾液细胞外囊泡miRNA辅助口腔鳞癌诊断与术后评估

叶伟龙 赵鹏程 马国武 孙 波

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]，目前临床上诊断OSCC时将组织病理作为金标准，但是技术上存在滞后性、创伤性、静态性、偏倚性等局限。本实验对文献中提到的几种差异表达的miRNA，以实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测目标miRNA在OSCC患者组和健康组之间，以及OSCC患者手术前后的表达差异，旨在探讨miRNA作为OSCC患者术前的辅助诊断和术后疗效评估的参考生物标志物的应用前景。

资料和方法

一、材料患者纳入及主要试剂准备

受试者：依照伦理委员会的标准，从2017年5月到2018年11月，征得患方同意并收集共计17例口腔鳞癌患者术前的唾液，年龄分布为38～79岁，其中男性12例，女性5例。按发病部位分为5例舌部，4例唇部，4例口底，2例颊部，2例牙龈（表1）。所纳入病例的TNM分类均为T2N0M0。作为对照组，收集11位40～80岁的健康志愿者的唾液。此外还提取了6例患者血液，以及7例患者术后1～3月的唾液，以检测其细胞外囊泡miRNA表达变化。

表1 OSCC患者临床特点

主要试剂：苯甲基磺酰氟、DNase/RNase-Free Water购自北京索莱宝公司。广谱蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司。RIPA裂解液、pH＝6.8和pH＝8.8的1mM Tris-HCL缓冲液、30%丙烯酰胺、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自中国碧云天公司。SDS L5750、过硫酸铵7727-54-0、TEMED17-1312-01购自美国Sigma-Aldrich公司。Total Exosome Isolation Kit购自美国invitrogen公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTMII、RNAiso Plus9108购自Takara公司。miRNA检测外参购自中国天根公司。Cel-miR-39-3p的引物购自广州锐博公司。Hsa-miR-10b-5p、Hsa-miR-486-5p、Hsa-miR-512-3p、Hsa-miR-412-3p的引物购自上海吉玛公司。

表2 蛋白免疫印迹使用抗体及浓度

提取唾液细胞外囊泡：每日上午，受试者空腹平静状态下，无菌管吸取口内唾液1～2mL于离心管，冰上放置。按照试剂盒说明书，向离心管内加入等体积PBS溶液，移液器吹打均匀分装，4℃离心取上清液，以样本体积：试剂体积＝2∶1的比例加入提取试剂，4℃过夜后再4℃离心，弃上清液。……