兔轮状病毒、兔肠冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

赵巧雅，宋丹丹，刘丽萍，郭效珍，刘存霞，盛 媛，史玉颖，黄 兵*

(1.山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250023；2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

兔轮状病毒(lapine rotavirus，LaRV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属，可感染各日龄兔尤其是1～2月龄幼兔[1]，造成腹泻[2]。该病传播迅速，发病急、发病率高，四季均可发生。兔肠冠状病毒(rabbit enteric coronavirus，RECV)为冠状病毒科冠状病毒属病毒，最早于1980年在加拿大腹泻症状幼兔身上发现[3]，后在健康兔中也观察到该病毒[4]。两者均是引起仔兔腹泻的重要病原，临床症状极为相似且存在混合感染情况，仅仅根据临床上的方法难以进行鉴别和诊断。目前，已有RT-PCR、荧光定量RT-PCR及LAMP等方法对牛轮状病毒[5]、猪轮状病毒[6]、牦牛源轮状病毒[7]、猪冠状病毒[8]、大鼠冠状病毒[9]等进行检测，而关于LaRV和RECV的双重RT-PCR检测方法在我国尚未见报道。

轮状病毒基因组编码6种结构蛋白和5种非结构蛋白。NSP3基因较为保守，人轮状病毒[10]、猪轮状病毒[11]等均针对NSP3基因建立了相关检测方法。N蛋白是一种碱性磷蛋白，是冠状病毒粒子主要结构蛋白之一，既具有高度保守性,又具有很强的免疫原性，在病毒RNA合成中发挥作用[12]，常用于抗原检测[13]。据报道，检测临床样本时N基因检测的灵敏度比ORF1b基因高10倍左右[14]。因此，本试验针对轮状病毒的NSP3基因、冠状病毒N基因设计特异性引物，建立了LaRV和RECV双重RT-PCR检测方法，并在山东部分规模化兔场采集样品进行检测，为LaRV和RECV的疫情监控、临床检测及流行病学提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品、病毒及菌株2020年4-7月，从10个山东规模化兔场采集107份腹泻兔粪便样品，所有样品单独分装，4℃保存送至实验室检测。……