贵州地方猪胶原蛋白特性及相关基因组织表达研究

杨 蓉，周 迪*，燕志宏，任丽群，李 平，李 俊，赵忠海，唐华江，龙清孟，龚 菲，陈昌雪，蒋桂荣

（1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550018，2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；3.遵义市畜牧渔业站，贵州遵义 563000；4.贵州省草业研究所，贵州贵阳 550025）

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的主要成分[1]，能够在肌肉和脂肪组织中广泛分布并形成微细的原纤维网[2-3]。研究表明，胶原蛋白的类型有18 种之多，且其含量和交联程度（主要指非还原性交联，羟赖氨酰吡啶嗡（HP）和赖氨酰吡啶嗡（LP）结构，统称为吡啶交联）是影响肉质的关键因素[4-6]。胶原分子中的羟基、酰胺基及氨基等极性基团能在水中与H 键相结合形成凝胶，对肉的胶粘性、弹性以及咀嚼性等性状具有重要影响；研究发现，III 型胶原蛋白是动物机体中最常见也是最主要的类型之一，其编码的COL3A1基因由3 条α1（III）链组成，其mRNA 表达水平对肌肉胶原蛋白含量具有重要作用[7-8]，也对其感官性状和肉质性状有一定影响。赖氨酰氧化酶（LOX）是促进弹性蛋白和胶原蛋白共价交联的关键酶，主要作用于细胞外基质（ECM）的胶原蛋白和弹性纤维，催化氧化ECM 中去氨基的赖氨酸和羟赖氨酸，以促进胶原蛋白分子间共价交联，形成网状结构，进而保持细胞外基质的完整和稳定。贵州地方猪具有皮糯肉嫩，风味极佳等优良特性，深受消费者青睐，为探索其内在原因，本研究以贵州地方猪柯乐猪、宗地花猪与杜长大杂交猪为实验对象，探究其肌肉和脂肪组织胶原蛋白特性及相关基因COL3A1、LOX在不同组织中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物与样品 柯乐猪、宗地花猪和杜大长杂交猪分别由赫章优农谷生态畜牧业有限公司、紫云紫薇畜牧业开发有限公司和贵州台农兴旺公司提供。随机选取体质健康、饲喂水平相同、体重约100 kg 的柯乐猪、宗地花猪和杜大长杂交猪各3 头进行屠宰，采集其皮下脂肪、背最长肌等组织，用0.9%生理盐水清洗后，置于液氮中暂存，带回实验室至-80℃超低温冰箱保存，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 胶原蛋白含量测定 称取0.2 g 组织样品置于试管中，加入2 mL 6 mol/L 盐酸提取液，100℃消化2～6 h，冷却至室温后，12 000 r/min、25℃离心20 min，随后用10 mol/L NaOH 调节pH 至6～8，取上清，测定管加入待测液60 μL，加入试剂一混匀静置20 min，加试剂二和H2O，混匀，60℃水浴20 min，室温静置15 min，酶标仪测定吸光值，绘制出标准曲线后计算羟脯氨酸（HYP）含量再换算成算胶原蛋白含量。

1.2.2 吡啶交联含量测定 称取1 g 组织样品用PBS（0.01 mol/L,pH=7.2～7.4）冲洗，剪碎放入玻璃匀浆器底部，加入9 mL PBS 在冰上研磨，5 000 r/min 离心15 min，取上清液待测。标准孔加标准品50 μL。空白孔加样品稀释液50 μL；样品孔先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，每孔加抗体100 μL，37℃避光孵育60 min。弃去液体，拍干，每孔加洗涤液静置1 min 甩去液体，拍干，重复5 次。加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，混匀，避光显色15 min。加终止液终止显色，用酶标仪测定450 nm 波长处的OD 值。再以标准物浓度为x 轴，OD 值为y 轴，绘制出标准品线性回归曲线，计算各样品浓度。

1.2.3 RNA 提取和cDNA 第一条链合成 采用Trizol法提取组织总RNA，根据RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒实验步骤将RNA 样品进行逆转录合成第一链cDNA，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 引物设计与合成 根据GenBank 数据库中猪LOX、COL3A1基因mRNA 序列，采用Primer 5 软件设计特异性荧光引物，选用GAPDH基因为内参基因，引物序列见表1，设计完毕后交由生工生物（上海）股份有限公司合成。

表1 LOX、COL3A1 基因引物信息

1.2.5 实时荧光定量PCR 用SYBR Green I 荧光染料法进行实时荧光定量PCR 实验，总体系为10 μL，cDNA 模板1 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SsoFASt EvaGreen Supermix 5 μL，RNase-free ddH2O 3.2 μL。反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃ 延伸1 min，39 个循环。熔解曲线以每5 s 上升0.5℃的速率从65℃升高到95℃。每个样品设3 个重复。

1.2.6 数据统计分析 利用Excel 2007 软件统计数据，并用2-ΔΔCt法计算LOX、COL3A1基因在不同猪种背最长肌和皮下脂肪的相对表达量。并用SPSS 19.0 分析软件对实验结果进行t检验和单因素方差分析，结果以平均值±标准差呈现。

2 结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线绘制 实验得出a 值为0.039，b 值为0.118 2，带入羟脯氨酸标准品线性回归方程y=0.039x+0.1183，R2为0.987 7。将所测样品ΔA（A测定管-A 空白管）的OD 值带入方程得出x 值。

2.2 胶原蛋白含量 如图1 所示，3 个品种皮下脂肪胶原蛋白含量均高于背最长肌组织，且在皮下脂肪和背最长肌中胶原蛋白含量均是宗地花猪最高，极显著高于柯乐猪和杜大长杂交猪，柯乐猪含量居中，杜大长杂交猪含量最低。

图1 不同品种和组织胶原蛋白含量（单位：µg/g）

2.3 吡啶交联标准曲线绘制 以标准品浓度为x 轴，OD 值为y 轴建立线性回归方程：y=kx+b，结果表明：HP 实验所得a 值为0.22，b 值为0.095 5，带入方程y=0.22x+0.0955，且R2=0.996 4；LP 实验所得a 值为0.377 7，b 值为0.033 7，带入方程y=0.3777x+0.0337，且R2=0.972 6。将所测样品OD 值带入方程，求出x 值。

2.4 宗地花猪、柯乐猪及杜大长杂交猪HP 含量、LP 含量差异性分析 如表2 所示，相同组织不同品种间采用单因素方差分析，对于同一品种的2 个组织间采用t检验。由表2 可知，对于HP 含量，在背最长肌中，宗地花猪、柯乐猪均极显著高于杜大长杂交猪，宗地花猪和柯乐猪之间差异不显著；在皮下脂肪中，柯乐猪含量最高，杜大长杂交猪次之，宗地花猪的含量最低，且柯乐猪显著高于宗地花猪，杜大长杂交猪与柯乐猪、宗地花猪之间均不呈显著关系。在同一品种不同组织中，3 个猪种皮下脂肪HP 含量均高于背最长肌，其中柯乐猪皮下脂肪HP 含量显著高于背最长肌，宗地花猪和杜大长杂交猪皮下脂肪HP 含量均极显著高于背最长肌。

表2 HP 含量、LP 含量比较分析结果

对于LP 指标，在背最长肌中，柯乐猪含量最高，杜大长杂交猪次之，宗地花猪最低，柯乐猪与杜大长杂交猪差异不显著，但均极显著高于宗地花猪；在皮下脂肪中，杜大长杂交猪含量最高，极显著高于柯乐猪和宗地花猪，柯乐猪含量高于宗地花猪但差异不显著。在同品种不同组织中，柯乐猪背最长肌中LP 含量极显著高于皮下脂肪，宗地花猪背最长肌中LP 含量显著高于皮下脂肪。

2.5LOX、COL3A基因RT-PCR 扩增结果 拟用于RTPCR 扩增引物，经梯度PCR 扩增检测，发现目的片段大小相近，且条带清晰、无杂带、无引物二聚体，说明引物特异性好，可直接用于RT-PCR 扩增。

2.6 实时荧光定量PCR 结果分析

2.6.1LOX基因差异表达分析 如图2 可知，在背最长肌中，杜大长杂交猪LOX基因表达量与柯乐猪和宗地花猪之间呈差异极显著，宗地花猪与柯乐猪之间未达到显著水平；在皮下脂肪组织，杜大长杂交猪极显著高于柯乐猪和宗地花猪；对同一猪种不同组织分析结果显示，3 个猪种皮下脂肪组织LOX基因表达均极显著高于背最长肌组织。

图2 LOX 基因在不同猪种组织表达水平

2.6.2COL3A1基因差异表达分析 如图3 所示，背最长肌组织COL3A1基因在宗地花猪中表达量极显著高于柯乐猪和杜大长杂交猪，柯乐猪次之，杜大长杂交猪最低；皮下脂肪组织COL3A1基因表达量宗地花猪显著高于柯乐猪，极显著高于杜大长杂交猪。同一品种不同组织分析结果显示，皮下脂肪COL3A1基因表达量均极显著高于背最长肌。

图3 COL3A1 基因在不同猪种组织表达水平

3 讨 论

胶原蛋白普遍存在于动物机体内的结缔组织、骨骼、肌肉、内脏器官等组织中，它对肌肉生长和保持肌肉塑性具有重要作用。本研究结果显示，在3 个猪种中，皮下脂肪胶原蛋白含量高于背最长肌组织，且宗地花猪2 个组织胶原蛋白含量高于柯乐猪和杜大长杂交猪。研究表明[10]，随着胶原蛋白含量增加，弹性增强，表明胶原蛋白含量越高，肉质就越富有弹性。另外胶原蛋白网状纤维结构使其具有很强的热收缩性，且与水分子结合能力较强，这使得胶原蛋白热溶解于水中呈凝胶状，因此，提高胶原蛋白含量使肉质更富有粘弹性和糯性，从而提高口感丰富度和咀嚼性。有研究表明，胶原蛋白影响肌肉嫩度，其含量与嫩度呈负相关[11-13]，而梁梦帆等[14]人却表明肌内结缔组织胶原蛋白能在一定程度上保持肉的嫩度。因此，关于胶原蛋白对肌肉嫩度的影响还需进一步探究，或许胶原蛋白含量对嫩度的影响只是在动物生长的某个年龄阶段。因为动物体在成熟后胶原蛋白数量不再增加，而是转变为胶原蛋白分子间交联程度的加强，胶原分子肽链之间可以形成共价交联（偶联）作用，主要是HP 交联和LP 交联，导致胶原蛋白的理化性质改变。HP 交联和LP 交联有很强的稳定性和机械强度，对肌肉嫩度和热溶解性有一定影响[15-16]。在本研究中，宗地花猪、柯乐猪背最长肌中HP 浓度均高于三元杂交猪，且宗地花猪的含量最高；但在脂肪组织却呈现与之不同的结果，宗地花猪与柯乐猪HP 含量均极显著低于外三元杂交猪；LP 交联在肌肉和脂肪组织中含量宗地花猪与柯乐猪均低于外三元杂交猪。Nishimura[17]曾提出脂肪沉积可破坏结缔组织结构，随着年龄增加，牛肉剪切力不再增加，且嫩度也有所改善，推测脂肪沉积破坏了结缔组织结构。卢桂松等[15]研究发现，随着脂肪沉积的增加，牛肉花纹等级提高，HP和LP 含量均有下降趋势，据此可推测，脂肪沉积可能会导致胶原蛋白交联结构发生改变，主要是非还原性交联HP 和LP。本研究表明，胶原蛋白含量在宗地花猪脂肪组织中最高，但HP 和LP 交联含量却较低，说明其脂肪沉积量较多[18]，分子间交联程度较小，溶解性增大，对HP 和LP 共价交联结构形成具有抑制作用，但具体影响机制还需继续探索。

本研究发现，COL3A1基因表达量在不同品种间存在差异，其表达量顺序依次为：宗地花猪＞柯乐猪＞杜大长杂交猪；在品种内不同组织表达量也存在差异性，即在皮下脂肪COL3A1基因表达量极显著高于背最长肌，这与组织本身胶原蛋白含量高低有一定关系。同时COL3A1基因表达趋势与胶原蛋白含量分布有一定相关性，胶原蛋白含量较多的组织和品种其表达量较高，即COL3A1基因表达水平越高，胶原蛋白含量越多；LOX是胶原蛋白分子间形成共价交联的关键性酶，其mRNA表达水平直接影响着胶原蛋白分子交联程度，表达水平越高，HP 和LP 交联含量越多，本实验中LOX基因mRNA 表达量在皮下脂肪中宗地花猪最低，其交联含量也是最低，但在肌肉却呈现不一样的规律，这除了与组织本身胶原蛋白含量及品种有关外，还有可能和脂肪沉积有一定关系，脂肪沉积可能对LOX基因表达具有调控作用，但具体调控机制有待进一步研究。

4 结 论

3 个猪种胶原蛋白含量皮下脂肪组织均高于背最长肌，与柯乐猪和杜大长杂交猪相比，宗地花猪2 个组织胶原蛋白含量较高，而交联含量却较低，HP 在皮下脂肪组织中宗地花猪显著低于柯乐猪和杜大长杂交猪，LP 含量在背最长肌中宗地花猪含量最低，表明宗地花猪交联含量越低，其热稳定性差，热溶解性较强，嫩度较好。COL3A1的表达与胶原蛋白含量呈正相关，即胶原蛋白含量越多，其表达水平越高；LOX的表达对HP和LP 交联含量有重要影响，其表达水平越高，交联越多，嫩度就越差。