叶酸对产蛋鸡血液免疫指标和肠道屏障功能的影响

武笑天，温 曌，李锐瑞，白 彦，王 瑞，杨 玉

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷 030801）

叶酸被认为是畜禽生长必须从饲料中获取的一种B 族维生素，NRC（1994）建议参考蛋鸡中叶酸添加水平为0.55 mg/kg，我国《蛋鸡复合预混合饲料》（GB/T 22544-2008）建议整个产蛋期蛋鸡叶酸添加量≥0.25 mg/kg。肠道不仅是营养物质吸收的主要场所，也是保护机体不受致病菌影响的重要防线，其健康发育对家禽至关重要。肠道机械屏障是由肠黏膜上皮细胞及其紧密连接等组成的完整的肠上皮细胞[1]。肠道化学屏障主要是指覆盖在肠上皮细胞的黏液层。黏蛋白2（MUC2）是由杯状细胞分泌的形成小肠黏液层的主要黏蛋白，可作为评价肠道健康状态的重要指标之一[2]。肠道免疫屏障通过分泌型免疫球蛋白A（SIgA）等阻止细菌和毒素侵入[3]。研究表明，叶酸能够提高畜禽的生产性能[4-6]，对蛋品质无影响[7-8]。雏鸡的生产性能和免疫力随饲粮叶酸含量的提高而增强，以1.0 mg/kg 时最高[9]。研究表明添加15 mg/kg 叶酸有提高仔猪血清免疫球蛋白G（IgG）含量的趋势[10]。添加150 μg 叶酸能够提高肉仔鸡血清IgG 和免疫球蛋白M（lgM）抗体水平[11]。王宝维等[12]研究表明，4 周龄鹅的饲粮中叶酸水平为1.60 mg/kg 时，IgG 比对照组提高了67.33 μg/mL。目前，本课题组研究发现，饲粮中添加叶酸，对蛋鸡生产性能无显著影响，但可以缓解产蛋鸡产蛋高峰期产蛋率自然下降幅度，显著提高其抗氧化能力；回归分析表明，饲料中叶酸的适宜添加量为3.75～6.40 mg/kg（未发表）。但有关叶酸对蛋鸡肠道屏障功能的研究还处于空白。本试验旨在研究饲粮中添加不同水平的叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血液免疫指标及肠道屏障功能的影响，为生产富叶酸鸡蛋提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计与日粮 试验选择 648 只30 周龄健康状况良好、体重相近处于产蛋高峰期的京红蛋鸡，随机分成6 处理，每处理6个重复，每重复18只鸡。采用单因素试验设计，分别在基础饲粮中添加1、3、6、12、24 mg/kg 叶酸，对照组饲喂基础饲粮（叶酸含量为0.35 mg/kg），基础饲粮参考京红蛋鸡营养标准并结合生产实际配制，其组成及营养成分见表1。叶酸由河北科泰生物科技有限公司提供，其有效成分95.5%～102.0%。试验预试期2 周，正试期6 周。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

1.2 饲养管理 采用3 层阶梯式笼养，每笼3 只鸡，连续的6 笼为1 个重复，各重复均匀分布于鸡舍同行中间2 层。全程粉料饲养，每天光照时间为16 h，鸡舍温度控制在25℃左右，自由饮水，每天喂食2 次（09:00、15:00），自然通风和纵向负压通风相结合。其他均按养殖场常规方法进行。

1.3 样品采集处理与指标测定

1.3.1 血清生化指标测定 试验期末空腹称重后，各重复随机选择1 只鸡，每组6 只鸡，使用不加抗凝剂的真空采血管翅静脉采血10 mL，静置分层，待血清大量析出后，吸取血清于离心管中，3 000 r/min 离心10 min，上清液分装到多个0.5 mL 离心管中，-20℃保存待用。送往上海酶联生物科技有限公司用ELISA 试剂盒测定血清中内毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、IgA、IgG、IgM 等相关血清指标。

1.3.2 肠道形态结构测定 鸡采血后，屠宰分离十二指肠、空肠、回肠，在各肠道中段剪下约1 cm 的肠段，用0.9%的生理盐水洗净后放入4%甲醛固定液中固定，固定好的肠组织经脱水-石蜡包埋-连续切片-苏木精-伊红染色，采用光学显微镜观察肠道，并以图像软件Image-Pro Plus 软件测量绒毛高度（Villus Height，VH）、隐窝深度（Crypt Depth，CD），计算绒隐比（绒毛高度/隐窝深度，VH/CD），每个样本观察2 个非连续切片，每张切片选取3 个视野，每个视野分别测定10 组数据，取平均值作为1 个测定数据。

1.3.3 肠道屏障功能相关基因表达量测定 采用Trizol法分别提取十二指肠、空肠和回肠组织总RNA。用核酸蛋白仪测定RNA 完整性、浓度和纯度。按照TaKaRa 反转录试剂盒说明合成cDNA，保存于-20℃。以cDNA 为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMII 试剂盒说明，在实时荧光定量PCR 仪上进行，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。目标基因闭合蛋白-1（Claudin-1）、闭锁蛋白（Occludin）、闭合小环蛋白-1（ZO-1）、MUC2、SIgA、TOLL 样受体4（TLR4）、核转录因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-13（IL-13）基因和内参基因β-actin的引物序列见表2，由上海生物工程公司合成引物。采用相对定量分析法，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 相对表达量。

表2 目的基因引物序列

1.4 统计分析 利用Excel 2010 软件初步整理数据，应用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan's 法比较组间差异显著性，并对相应的数据进行线性和二次曲线回归分析。结果以平均值和标准误（SEM）表示。P＜0.05 表示差异显著，0.05≤P＜0.10 表示有趋势，使用Graph Pad Prism 8 软件作图。

2 结果

2.1 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血清免疫球蛋白含量的影响 由表3 可知，饲粮中添加叶酸对IgG 含量无显著影响；6 mg/kg 组IgA 和IgM 含量均高于对照组（P＜0.05）、1 mg/kg 组（P＜0.05），与12、24 mg/kg组无显著差异。IgA 和IgM 含量随叶酸水平的升高均呈二次曲线反应（P＜0.05），其中6 mg/kg 组IgA 和IgM含量最大，分别为212.67、545.21 μg/mL。

表3 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血清免疫球蛋白含量的影响 μg/mL

2.2 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道屏障功能的影响

2.2.1 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道组织形态的影响由表4 可知，6 mg/kg 组十二指肠VH 高于其余各组（P＜0.05）；1、6、24 mg/kg 组空肠VH 高于对照组、12 mg/kg 组（P＜0.05），6 mg/kg 组空肠VH/CD 高于对照组、12 mg/kg 组（P＜0.05），而对其他各组无影响。饲粮中添加叶酸有增加十二指肠VH/CD 的趋势，对回肠VH、CD 及VH/CD 均无显著影响。随着叶酸水平的升高，十二指肠VH 呈二次曲线反应（P=0.066），6 mg/kg 组最大，为1 805.26 μm。

表4 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道组织形态的影响

2.2.2 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道紧密连接蛋白和MUC2mRNA 表达量的影响 由表5 可知，饲粮中添加6 mg/kg 的叶酸，十二指肠OccludinmRNA表达量高于对照组、1、3 mg/kg 组（P＜0.05），ZO-1 mRNA 表达量高于其余各组（P＜0.05）；饲粮中添加叶酸对十二指肠Claudin-1 mRNA 表达量无显著影响；3、6mg/kg 组MUC2mRNA 表达量高于除12 mg/kg 组外的其余各组（P＜0.05）。饲粮中添加叶酸增加了空肠Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC2和回肠Occludin、ZO-1mRNA 表达量（P＜0.05），其中6 mg/kg 组最高。饲粮中添加叶酸增加了MUC2mRNA 表达量（P＜0.05），其中12 mg/kg 组最高，添加叶酸有增加回肠Claudin-1mRNA 表达量的趋势（P=0.057）。十二指肠Occludin、Claudin-1、MUC2和空肠Occludin及回肠Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表达量呈二次曲线反应（P＜0.05），其中3 mg/kg 组和12 mg/kg 组十二指肠和回肠MUC2mRNA 表达量最大，分别为1.54、1.60；其余均以6 mg/kg组最大，分别为1.85、1.49、1.71、1.40、1.91。

表5 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道紧密连接蛋白、MUC2 mRNA 表达量的影响

2.2.3 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血清DAO 活性、D-LA和ET 含量的影响 由表6 可知，3、6 mg/kg 组的D-LA 浓度低于对照组、1、24 mg/kg 组（P＜0.05）；6、12 mg/kg 组DAO 浓度低于对照组、3、24 mg/kg 组（P＜0.05）；12 mg/kg 组ET 浓度低于除6 mg/kg 组的其余各组（P＜0.05）。随着叶酸水平的升高，D-LA、DAO、ET 浓度均呈二次曲线反应（P＜0.05）。其中D-LA、DAO 浓度以 6 mg/kg 组最小，分别为43.63 μmol/mL、14.34 U/mL；ET 浓度以12 mg/kg 组最小，为45.81 ng/mL。

表6 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血清DAO 活性、D-LA 和ET 含量的影响

2.2.4 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道免疫细胞因子mRNA 表达量的影响 由图1、图2、图3 可知，6、12 mg/kg 叶酸组十二指肠和空肠SIgAmRNA 表达量高于对照组、1 mg/kg 组（P＜0.05）。6、12、24 mg/kg组十二指肠NF-κBmRNA 表达量低于对照组（P＜0.05）；6 mg/kg 组TNF-αmRNA 表达量低于对照组、12、24 mg/kg 组（P＜0.05）；饲粮中添加叶酸降低了十二指肠TLR4mRNA 表达量（P＜0.05）、增加了IL-10 和IL-13 mRNA 表达量（P＜0.05）。饲粮中添加叶酸降低了空肠TLR4、NF-κBmRNA 表达量（P＜0.05），增加了IL-10 mRNA 表达量（P＜0.05）；3 mg/kg 和6 mg/kg组IL-1βmRNA 表达量低于其余各组（P＜0.05）。饲粮中添加叶酸降低了回肠TNF-αmRNA 表达量（P＜0.05），降低了除24 mg/kg组外的TLR4mRNA表达量（P＜0.05）；3、6、12 mg/kg 组IL-13 mRNA 表达量高于对照组（P＜0.05）。

图1 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡十二指肠免疫细胞因子mRNA 表达量的影响

图2 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡空肠免疫细胞因子mRNA 表达量的影响

图3 饲粮中添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡回肠免疫细胞因子mRNA 表达量的影响

3 讨 论

3.1 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡血清免疫球蛋白含量的影响 IgA、IgG 和IgM 主要由B 淋巴细胞分泌，在体液免疫中起着重要作用。因此，免疫球蛋白水平的高低是动物机体免疫功能的重要标志[13]。添加叶酸能增加嘌呤和嘧啶含量，加快DNA 和RNA 合成，与维生素B12、维生素C 共同参与红细胞和血红蛋白的生成，促进了免疫球蛋白的生成。Erickson 等[14]研究表明，叶酸可以参与细胞先天性免疫，增加免疫器官重量，调控机体的内分泌水平，从而影响其免疫性能。葛文霞等[15-16]研究证实，叶酸水平为3.0 mg/kg 时21 日龄肉仔鸡血清中IgG含量显著提高，IgA 和IgM 没有显著变化。本试验结果

表明，6 mg/kg 叶酸可显著增加蛋鸡血清中IgA 和IgM含量，却对IgG 无显著影响，与葛文霞等[15-16]的研究结果不一致，推测其原因可能与鸡种、鸡体所处生理状态不同有关。由于母源IgG 可通过卵黄直接补充，所以雏禽在出壳后3～5 d 内始终保持较高的IgG 水平，直到7 日龄左右开始下降，20～22 日龄后基本检测不到，这使雏禽在自身免疫系统健全以前也可以得到有效保护，且禽类各种免疫球蛋白在种系进化和个体发育中出现的时间不同。

3.2 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道屏障功能的影响

3.2.1 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道组织形态的影响小肠是营养物质消化和吸收的主要器官，也是机体防御体系的第一道屏障，在维持肠道正常营养代谢和肠道屏障功能等方面发挥着重要作用[17-18]。肠道黏膜作为家禽机体最重要的黏膜系统，其形态结构和功能的完整性是维护肠道健康的有效屏障[19]。当VH/CD 增加，肠道吸收功能和消化功能增强，肠道黏膜屏障功能得到明显改善。本试验中，6 mg/kg 叶酸可显著增加十二指肠VH、空肠VH 和VH/CD，说明饲粮中适宜添加水平的叶酸有利于促进蛋鸡肠道发育。其主要原因为：叶酸参与嘌呤环和脱氧核苷酸的生物合成，具有促进核酸生物合成的作用；叶酸作为一碳单位的载体，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；叶酸能够提供甲基给甲基受体，使甲基受体成为甲基衍生物。

3.2.2 叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡肠道紧密连接蛋白、MUC2mRNA 表达量及肠道通透性的影响 肠道屏障的完整性能防止肠道微生物中的病原体和有害物质进入体内，同时也能维持机体内环境稳态。大量研究表明，肠道机械屏障的损伤与许多疾病的发生、发展息息相关[20-21]。紧密连接Claudin-1、Occludin、ZO-1 是肠道黏膜机械屏障的关键组成部分[22]，可以调节肠道屏障通透性，防止细菌和毒性大分子物质进入身体。MUC2 和Claudin-1是重要的肠上皮屏障组分，可防止有害物质到达肠上皮表面，抵御病毒和病原菌入侵。当家禽的肠黏膜紧密连接结构被破坏时，肠道通透性增大[23]，血液中ET和D-LA 含量增加[24]，DAO 活性提高，因此，血液中DAO 水平可反映肠道损伤和修复情况[25]。叶酸能一定程度上降低肠道有害菌数量、优化肠道菌群[26]，降低肠道内毒素含量，使肠黏膜受损几率降低，防止肠上皮释放大量的DAO 进入血液。目前仍未见叶酸影响家禽肠道通透性的研究。本试验结果显示，饲粮中添加6 mg/kg 和12 mg/kg 叶酸显著增加了十二指肠、空肠和回肠Occludin、ZO-1、MUC2mRNA 表达量，显著降低了血清ET 含量和DAO 活性，提示适量叶酸可以有效降低肠道通透性，改善家禽肠道黏膜损伤，抑制由于肠道通透性的增加而导致的内毒素移位，具体机制有待研究。

3.2.3 叶酸对产蛋高峰期京红蛋肠道免疫屏障细胞因子mRNA 表达量的影响 肠道功能和通透性受免疫球蛋白和多种细胞因子的影响，这些炎性介质可能进入血液，然后作用于肠黏膜上皮细胞并影响肠道完整性和功能[27]。TLR4 能够调节促炎因子IL-1β的分泌，还能通过诱导肠上皮细胞与巨噬细胞的交互作用提高抗炎因子IL-10的表达[28]，IL-1β和TNF-α能够通过影响肠上皮细胞完整性和肠道通透性增加[29]。IL-10 不仅能抑制TLR4、NF-κB 炎症信号反应，还能维持肠道屏障功能[30]。IL-13 能够在体内抑制活化的T 细胞产生炎性细胞因子，抑制炎症反应的发生。SIgA 和细胞因子等是构成肠道免疫屏障的主要组成成分[31]。肠道炎症反应主要受细胞因子的调节。在动物机体内，TIR4/NF-κB 信号通路可调节细胞因子的产生，但在家禽体内叶酸是否通过TIR4/NF-κB 信号途径调节细胞因子表达未见报道。本研究表明，6 和12 mg/kg 组叶酸显著降低了十二指肠TLR4、NF-κB、TNF-α及回肠TLR4、TNF-αmRNA表达量，显著增加了十二指肠SIgA、IL-10、IL-13 和回肠IL-13 mRNA 表达量；添加3、6 mg/kg 叶酸显著降低了空肠TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA 表达量，显著增加了IL-10 mRNA 表达量，表明添加适量叶酸能够减少促炎性细胞因子的合成量，减缓肠道中的炎性反应，保护肠道发育，且以6 mg/kg 较好。

4 结 论

本试验结果显示，日粮中添加6 mg/kg 叶酸提高产蛋鸡血清免疫球蛋白IgA 和IgM 含量，降低D-LA、ET 含量及DAO 活性；改善十二指肠和空肠的黏膜形态，增加小肠Occludin、ZO-1、MUC2以及十二指肠中SIgAmRNA 的表达；通过抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路，进而抑制促炎细胞因子的表达，提高抗炎性细胞因子的表达，进而改善了肠道的屏障功能。