猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染病例的实验室诊断

吴 燕， 陈 静， 杨 鹏， 尹德晶， 程振涛*

(1. 贵州省贵阳市花溪区马铃乡农业服务中心，贵州 贵阳 550027； 2. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

2021年1月，贵阳市某养殖场猪群陆续出现不明原因死亡病例，病初出现被毛粗乱、消瘦、发热、喘气等症状，随后发病猪陆续死亡，病猪死亡前耳朵及全身有轻微发紫现象，病死率达80%，病程8～10 d。为了查明病因，特进行实验室病原学检测。

1 材料与方法

1.1 检测病料取3头病猪血液(3份)、组织病料(肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结各2份)作为检测病料。

1.2 主要试剂及仪器(1)主要试剂：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用型实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、猪瘟病毒(CSFV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自北京世纪元亨公司；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker试剂、2×TaqPCR MasterMix，购自大连宝生物工程有限公司。(2)主要仪器：普通PCR仪[TC-96/G/H(b)B]，购自杭州博日科技有限公司；荧光定量PCR仪(Line-genek)，购自杭州博日科技有限公司；电泳凝胶成像仪(SYGENE)，购自Gene公司。

1.3 血液及组织样品DNA/RNA提取取3份血液样品100 μL，按DNA/RNA提取试剂盒说明书方法室温环境提取血液总DNA和RNA；取肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结各1 g于灭菌研钵，加入生理盐水1.5 mL快速研磨，匀浆后转入1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清液100 μL，按DNA/RNA试剂盒说明书方法室温环境提取各组织的总DNA和RNA。

1.4 相关病毒核酸检测

1.4.1 PCV-2核酸检测分别以血液和组织样品的总DNA为模板，采用PCR方法进行PCV-2检测。扩增体系25 μL：2×TaqMixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物(PCV2-P1：5’-AAGGGCTGGGTTATGG TATG-3’；PCV2-P2：5’-CGCTGGAGAAGGAAAAAT GG-3’)各1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水 8.5 μL。 反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃变性30 s，72 ℃延伸 45 s，共35次；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳(110 V，25 min)，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段353 bp)。……