铁皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因克隆与表达分析

林江波，邹 晖，王伟英，戴艺民

（福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意义】植保素（Phytoalexin，又称植物抗毒素）是一类具有物种特异性的小分子有机化合物，具有抗菌和驱虫活性，受到病原菌或害虫诱导产生[1]。目前已经鉴定的植保素主要有黄酮类、萜类、芪类、吲哚类、生物碱类和香豆素类等[2-3]。禾本科（Poaceae）植物主要产生二萜或黄酮类植保素[4-5]、豆科（Fabaceae）植物主要产生异黄酮类植保素[6]、茄科（Solanaceae）植物主要产生萜类植保素[7-8]。螺岩兰草酮（Solavetivone）是一种倍半萜类植保素。豆腐柴螺二烯（Premnaspirodiene）合成酶催化法呢基二磷酸（FPP）环化形成豆腐柴螺二烯[9]，豆腐柴螺二烯在豆腐柴螺二烯加氧酶（Premnaspirodiene oxygenase）催化下，经过羟基化和氧化形成[10]螺岩兰草酮。因此，豆腐柴螺二烯加氧酶是螺岩兰草酮合成的关键酶。【前人研究进展】黄果茄（Solanum xanthocarpum）是一种重要的民间医药，具有杀虫、抗菌[11-12]等功效，其根系提取的精油中，螺岩兰草酮占22.9%[13]。DESJARDINS 等[14]研究发现，马铃薯（Solanum tuberosum）受到线虫侵染后，抗病品种和感病品种根系的倍半萜烯含量变化不大，但是螺岩兰草酮在倍半萜烯中的比例显著提高。YAO 等[15]研究结果表明马铃薯试管苗用丛枝菌根菌（Glomus etunicatum）菌根化后受到立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染，根部螺岩兰草酮和日齐素（Rishitin）含量显著增加，通过培养皿生物测定，螺岩兰草酮和日齐素抑制立枯丝核菌菌丝生长。KAWAUCHI[16-17]等用茉莉酸甲酯和硫酸铜处理天仙子（Hyoscyamus albus）毛状根，会诱导合成螺岩兰草酮及其衍生物，并克隆了螺岩兰草酮合成酶基因豆腐柴螺二烯加氧酶基因（hahpo1）。【本研究切入点】铁皮石斛（Dendrobium officinale）属兰科（Orchidaceae）石斛属（DendrobiumSw.）药用植物，具有增强免疫力、抑制肿瘤等功效[18-21]。目前，鲜见铁皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因的相关研究报道。【拟解决的关键问题】本课题组从不同营养生长期铁皮石斛叶片转录组测序数据中筛选差异表达基因时，获得1 条带5′末端的铁皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因cDNA片段，根据cDNA 序列信息设计3′RACE 引物，利用RT-PCR 技术克隆基因全长cDNA 序列和ORF，分析豆腐柴螺二烯加氧酶基因在铁皮石斛不同营养生长阶段和开花期不同器官中的表达，以期为进一步鉴定基因功能及探讨铁皮石斛植保素的生物合成及抗病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 冠豸山铁皮石斛开花期的根、茎、叶和花及8 月、10 月和12 月的叶片。

1.1.2 试验试剂 宝生物工程有限公司的PrimeScriptTMReverse Transcriptase 和pMD19-T；湖南艾科瑞生物工程有限公司的SteadyPure植物RNA 提取试剂盒、2×Accurate Taq Master Mix（dye plus）和SYBR GreenPro TaqHS 预混型qPCR 试剂盒；测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 DoPO 基因克隆

根据转录组测序获得的带5′端的DoPO基因序列信息设计3′RACE、克隆开放阅读框引物及3′RACE接头引物，引物见表1，下同。由冠豸山铁皮石斛叶片提取的总RNA 逆转录的单链cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 产物经克隆后测序。

表1 PCR 引物及其序列Table 1 PCR primers and sequences

1.3 生物信息学分析

利用BLAST P 在GeneBank 中搜索DoPO 氨基酸序列相似性和保守结构域。利用ProtParam 预测DoPO 蛋白的理化性质。系统进化分析（Neighbor Joining Tree,Bootstrap 1 000）和进化树构建由MEGA 6.0 软件完成[22]。

1.4 DoPO 基因表达分析

按照SteadyPure植物RNA 提取试剂盒的说明提取各样品的RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase逆转录成cDNA，浓度定量为200 ng·μL-1。设计qPCR引物PO-F 和PO-R，扩增长度为149 bp。Actin基因属于持家基因，在细胞中组成型表达，常用于基因表达分析的内参基因。选择铁皮石斛Actin作为内参基因，引物为DoACT-F 和DoACT-R，产物长度为215 bp。实时荧光定量PCR 参考林江波等的方法[23]。

2 结果与分析

2.1 DoPO 基因的3′RACE 克隆

用随机引物反转录的cDNA 为模板，用引物3PO-1 和dT-Adpt、引物3PO-2 和Adpt 先后进行二轮PCR，电泳结果见图1A，在500 bp 左右有1 条特异性条带。胶回收目的片段，经过克隆和测序后，用DNAMAN V6.0 对3′-RACE 的测序结果进行序列拼接和ORF 的分析。结果表明获得DoPO基因cDNA全长，长度为1 704 bp (图2)，含1 个编码498 个氨基酸的完整阅读框架，5′末端非翻译区40 bp，3′末端非翻译区167 bp。

图1 PCR 电泳结果Fig.1 PCR products by electrophoresis

图2 铁皮石斛DoPO 基因cDNA 序列及其推导的氨基酸序列Fig.2 Sequences of cDNA and its deduced amino acids of DoPO from D.officinale

2.2 DoPO 基因ORF 克隆

以随机引物反转录的铁皮石斛叶片cDNA 为模板，利用引物DoPO-F 和DoPO-R 进行PCR 扩增，PCR 产物电泳结果（图1B）显示，在1 532 bp 处有1 条特异性条带。PCR 产物经过克隆和测序，结果表明：获得了带BamH I 和XhoI 酶切位点的DoPO基因ORF。提取质粒pMD19-T-DoPO，－20℃保存。

2.3 生物信息学分析

DoPO 蛋白的分子量为56.914 kD，属不稳定蛋白。使用BLAST P 检索DoPO 蛋白保守结构域和同源序列，结果表明：DoPO 蛋白属于p450 超级家族，氨基酸序列与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris,XP 020571355）、深圳拟兰（Apostasia shenzhenica,PKA52400）和埃及莨菪（Hyoscyamus muticus,A6YIH8）的PO 氨基酸相似度分别为85%、76%和70%。将DoPO 与其他15 个物种的PO 氨基酸序列进行系统进化分析，结果表明（图3）：16 个物种聚为4 大类，铁皮石斛与兰科植物的姬蝴蝶兰（XP 020571355）和深圳拟兰（PKA52400）聚为一类，与姬蝴蝶兰亲缘关系最近；棕榈科的海枣（Phoenix dactylifera,XP_038978059）和油棕（Elaeis guineensis,XP_010910607）聚为一类；茄科植物的埃及莨菪（Hyoscyamus muticus,A6YIH8）、天仙子（Hyoscyamus albus,BAN58140）、马铃薯（Solanum tuberosum,NP_001305614）、潘那利番茄（Solanum pennellii,XP_015072942）和番茄（Solanum lycopersicum,XP_004237369）聚为一类。

图3 不同物种豆腐柴螺二烯加氧酶的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of premnaspirodiene oxygenase from different species

2.4 DoPO 基因在不同器官的表达

以Actin基因作为内参基因，qRT-PCR 检测DoPO基因在铁皮石斛开花期不同器官的表达，结果表明（图4），花、茎、叶和根都能检测到DoPO基因的表达，表达量的高低依次为叶＞花＞根＞茎，而且表达量存在极显著差异。

图4 DoPO 基因在不同器官的表达Fig.4 Expression of DoPO in various organs

2.5 DoPO 基因在不同营养生长期叶中的表达

为了进一步分析DoPO基因在铁皮石斛不同营养生长阶段叶片中的表达模式，利用荧光定量PCR 技术分析了铁皮石斛叶片DoPO基因在8、10、12 月份的表达情况，结果表明（图5）：10 月份的表达量最高，与8、12 月份的差异极显著。其次是12 月份，与8 月份的差异显著。

图5 DoPO 基因在叶中的相对表达量Fig.5 Relative expression of DoPO in leaves

3 讨论与结论

豆腐柴螺二烯加氧酶是植物合成植保素螺岩兰草酮的关键酶。TAKAHASHI 等[10]克隆了埃及莨菪的HPO基因，其编码蛋白属于P450 超级家族成员，体外酶活性实验表明，具有催化豆腐柴螺二烯形成螺岩兰草酮的活性；此外，还可以催化几种艾里莫芬烷型（十氢化萘环系统）倍半萜烯C-2 的羟基化。细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶是一类血红素蛋白类酶，具有氧化、羟基化和去甲基化等多种催化活性[24]，如果氨基酸序列一致性高于40%属于同一个家族，高于55%则属于同一个亚家族[25]。本研究克隆了铁皮石斛的DoPO基因，属于P450 超级家族，核苷酸序列与埃及莨菪HPO（A6YIH8）的氨基酸相似度为70%，属同一亚家族，推测DoPO具有催化豆腐柴螺二烯形成螺岩兰草酮的活性。

植保素一般在病原菌或害虫侵害后几个小时开始形成和累积[26]，是植物对抗病原菌、害虫等侵害的一种防御机制[27-28]。KAWAUCHI 等[16]克隆了天仙子的hahpo1 基因，茉莉酸甲酯处理后24 h、茉莉酸甲酯和硫酸铜共同处理后6 h 能检测到hahpo1 基因的表达，未处理没有检测到表达。本研究发现铁皮石斛DoPO基因在叶、茎、根和花中都有表达，但叶的相对表达量最高，茎的相对表达量最低，叶片DoPO基因的相对表达量又以10 月份最高。从铁皮石斛DoPO基因表达模式来看，在整个生长期，各器官可能都有合成一定量的螺岩兰草酮，这需要通过检测各器官的螺岩兰草酮含量来进一步验证。

本研究克隆了铁皮石斛DoPO基因，分析了其在不同器官和营养生长期叶片的表达模式，为进一步研究其催化功能和探讨铁皮石斛植保素的生物合成及抗病机制奠定基础。