自噬在肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞凋亡中的作用

史方富,崔红旺,孙 博

成骨细胞与破骨细胞的平衡维持着人体正常的骨量，成骨细胞形成缺陷或者异常凋亡将会引起骨质疏松等一系列疾病[1]。炎症因子在导致骨质疏松中发挥着重要的作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 是经典的多效促炎性细胞因子，其表达水平与骨损伤呈正相关[2]，实验研究[3]发现,TNF-α可以诱导成骨细胞凋亡。自噬是机体内的一种自我修复程序，可以清除受损的细胞器，维持细胞的稳态，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞的自噬在维持骨稳态中起着关键作用，自噬活性降低会加速细胞凋亡[4]。本研究观察小鼠MC3T3-E1成骨细胞株的自噬在TNF-α诱导成骨细胞凋亡中的作用，为治疗骨质疏松寻找潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、试剂和仪器小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自中国科学院上海细胞库。TNF-α、雷帕霉素(RAP)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Sigma-Aldrich公司，DMEM-F12 培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司。细胞凋亡检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司，微管相关蛋白Ⅰ/Ⅱ轻链3(LC3-Ⅰ/Ⅱ)抗体、内参GAPDH抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗购于Cell Signaling公司，聚氟乙烯膜购于Millipore公司。细胞培养箱购自SANYO公司，Elx800 全波长酶标仪购自Bio Tek公司，流式细胞仪购自BD Biosciences公司。

1.2 细胞培养以及实验分组MC3T3-E1成骨细胞株接种于DMEM-F12培养基(含10% FBS+1%青霉素/链霉素)，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，细胞融合度约达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代，得到培养液。参考文献[5]方法进行分组：① 对照组——培养液不做处理；② TNF-α观察组——培养液中加入40 μg/L TNF-α；……