胃癌根治性手术前后TM4SF1水平及病理特征变化研究

郭俊龙，梁 滨，田伟军

(1.天津市宁河区医院，天津301500；2.天津医科大学总医院，天津300052)

由于人们生活习惯的改变，饮食不规律，生活压力过大，胃癌的发病率逐年上升。据国家癌症中心2015年相关数据显示，胃癌发病率仅次于肺癌，居住地恶性肿瘤发病率居第二位。胃癌(GC)是最常见的恶性胃肠道癌，也是全球第二大癌症相关死亡原因[1-3]。尽管治疗手段的进步，GC的预后仍然很差。许多病人在诊断时被发现患有晚期肿瘤，无法切除。这些患者的总生存率(OS)低于12个月。胃癌的早期诊断、靶向治疗和预后评估中新的生物标志物的研究具有重要的临床意义。手术是治疗早期胃癌的主要方式，但肿瘤的复发、转移以及扩散与机体免疫水平有关[4]。为了探讨胃癌患者根治性手术的效果及相关指标对预后情况的判断，本文选取天津市宁河区医院2016年6月到2019年6月共收治的80例胃癌患者进行回顾性分析，探讨胃癌根治性手术前后TM4SF1(跨膜4超家族成员1)水平及病理特征变化。具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取天津市宁河区医院2016年6月到2019年6月共收治的80例胃癌患者进行回顾性分析，所有患者均行胃癌根治术。入选标准：经胃镜检查及组织病理学确诊为胃癌；符合胃癌根治性手术指征；能够接受紫杉醇、氟尿嘧啶等常规化疗药物治疗[5]；身体状况及血液检查均能耐受化疗；研究经医院伦理委员会批准，患者签字同意。排除标准：胃癌远端转移，不能进行根治性手术；合并其他严重恶性肿瘤；合并心、肝、肾等器官疾病；合并感染性或代谢性疾病；有慢性营养不良史。所有患者中男性45例，女性35例；年龄为42到68岁，平均年龄(54.32±8.92)岁；病程3个月到1年，平均(0.64±0.34)年。

1.2 方法

TM4SF1染色的免疫组化及定量分析：石蜡包埋切片(4 μm厚)去石蜡切片，再水化，在10 mmol/L柠檬酸钠(pH 6.0)中加热10 min，以回收抗原。内源性过氧化物酶用3%H2O2猝灭。在4℃下与一级抗体(抗TM4SF1，1∶200，Abcam)孵育后，用辣根过氧化物酶标记的聚合物与二级抗体(Max Vision)结合培养TM在室温下15 min后，在二氨基联苯胺中显影并用苏木精轻微复染。阴性对照组除不加原发性抗体外，其余程序均相同。免疫组化结果由两名对临床资料不了解的病理学家独立评估。在×200的条件下，对每个截面进行了5个随机视野检查。肿瘤组织中TM4SF1的表达程度采用分级系统：0，阴性染色；1，浅黄色；2，浅棕色；3，深褐色。得分0定义为TM4SF1阴性，分数1-3为TM4SF1阳性。

免疫分析法：将均质化的根治性手术前胃癌组织和根治性手术后胃粘膜组织织标本置于RIPA裂解缓冲液中进行裂解。在4℃下将裂解物(13 800 g)离心30 min。上清液用于Western blotting分析。用十二烷基硫酸钠(SDS)负载缓冲液变性，在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，用兔抗TM4SF1单克隆抗体(1∶1000稀释度，Abcam)或小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶2000稀释度，Sigma-Aldrich)在4℃下孵育过夜。在用Tris-缓冲盐水和吐温-20(TBST)洗涤3次，每次10 min后，在室温下用辣根周氧化酶(HRP)结合的小鼠抗兔IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)探测1 h。用TBST洗涤后，使用化学发光光电表面辣根过氧化物酶试剂盒符合制造商的说明。用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA)用密度计测量谱带强度。TM4SF1蛋白水平标准化为GAPDH。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 80例胃癌患者根治术前胃癌组织及邻近非胃癌组织中TM4SF1表达

我们用免疫组化方法检测了TM4SF1在胃癌组织及其邻近非癌组织中的表达。结果表明，在同一切段中，TM4SF1在GC组织中呈阴性表达，在相邻非癌组织中呈阳性表达(图1A)。在我们的患者队列中，免疫组化分析显示，在GC组织中TM4SF1的表达率(11.25%，9/80)显著低于非癌性胃粘膜组织(72.50%，58/80)(图1B)。

图1 TM4SF1表达水平高、表达强与GC组织分化程度高有关。用免疫组织化学方法检测了TM4SF1在GC组织中的表达。TM4SF1(D)在(A)分化良好、(B)中度和(C)低分化GC组织中的表达率。

2.2 80例胃癌患者根治术后胃粘膜中TM4SF1水平表达情况对比分析

为探讨TM4SF1在胃癌患者根治术后胃粘膜中的表达和定位，我们用正常胃粘膜石蜡切片进行免疫组织化学染色。结果显示，大多数心脏和幽门粘膜中没有TM4SF1染色(图2A，C)。TM4SF1染色见于基底粘膜(图2B)。值得注意的是，TM4SF1蛋白主要在固有腺体中表达，而在基底粘膜的宫颈粘液细胞中不表达。肠化生粘膜中也可见TM4SF1染色(图2D)。TM4SF1染色在基底腺的主细胞中比在壁细胞中更强烈(图2E)。统计分析表明，TM4SF1在胃底黏膜组织中的表达率(89.65%，52/58)高于心脏(16.67%，1/6)和幽门(16.67%，2/12)黏膜组织(图2F)。胃底和化生粘膜中TM4SF1的阳性表达率无显著差异(75.00%，3/4)(图2F)。提示TM4SF1在胃癌患者根治术后胃粘膜中呈异质性表达，在胃底黏膜中有较高的表达率。

图2 TM4SF1在胃癌根治术后胃黏膜中的表达及定位。用免疫组化法检测根治术后胃黏膜中TM4SF1的表达。(A) 心脏黏膜，(B)胃底黏膜，(C)幽门黏膜，(D)肠化生黏膜。(E) TM4SF1在基底腺主要细胞和壁细胞中的表达，(F) 胃组织特异性表达TM4SF1。

2.3 胃癌根治术前后TM4SF1表达水平对比

为了证实根治术前胃癌组织中TM4SF1蛋白水平低于根治术后胃黏膜组织，我们用Western印迹法比较了13对新鲜冷冻GC和根治术后胃黏膜标本中TM4SF1蛋白水平。结果显示，与匹配的非癌组织样本(7.69%，1/13)相比，这些配对样本在根治术前中表现出较低的TM4SF1表达(61.54%，8/13)(图3)。这些数据表明胃癌根治术前TM4SF1水平低于胃癌根治术后。

图3 胃癌根治术前胃癌组织中TM4SF1水平低于根治术后。用免疫印迹法检测肿瘤组织和根治术后胃黏膜组织中TM4SF1的表达。C、癌组织；N，根治术后胃黏膜组织。GAPDH是定量的负荷控制和标准化参考。

2.4 胃癌根治术前后患者的病理特征对比分析

为了探讨胃癌根治术对胃癌患者的治疗效果，对比分析了根治性手术前与根治性手术后1年两组患者的病理特征，结果显示，手术前与手术后胃癌患者的肿瘤Borrmann分型、肿瘤pTNM分期、肿瘤pN分期患者不同分期人数对比差异显著，如表1所示。

3 讨论

胃癌是一种常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界前列。胃癌大多是通过胃炎-萎缩-肠-不典型增生的过程演变而来，其中萎缩、肠和不典型增生是胃癌的癌前病变[6-7]。本病早期无明显症状，导致大多数患者发现本病已发展到晚期，无法通过手术治愈。因此寻找能够判定患者胃癌根治术治疗前后患者预后情况判断的指标具有重要价值。

表1 胃癌根治术前后患者的病理特征对比分析(n=80)

在本研究中，我们发现根治性手术前胃癌组织中TM4SF1蛋白水平低于根治性手术后胃粘膜组织。而且，TM4SF1的高表达率和高分化的GC组织有关。提示TM4SF1低表达与胃癌的发生发展有关。这与肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌不同，后者的TM4SF1 mRNA和蛋白水平都很高。相关研究表明[8-9]，TM4SF1在胰腺癌组织和细胞系中的表达高于对照组。TM4SF1基因敲除抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。在HepG2细胞中过度表达TM4SF1可导致细胞凋亡减少和细胞迁移增加，并促进肿瘤生长和体内转移。TM4SF1在癌变和发展中的作用可能是组织特异性的[10]。

我们还评估了TM4SF1在GC患者中的预后意义，发现TM4SF1的低表达与较差的总体生存率相关，这表明TM4SF1可能是GC患者的一个新的预后标记物[11]。这与肌肉浸润性膀胱癌、胰腺癌和胶质瘤等癌症不同TM4SF1的过度表达与这些癌症的预后不良有关。因此，TM4SF1表达作为预后标志物的作用取决于癌症的类型。

USP10、S100A12、p53和Ki67是癌症侵袭和转移的肿瘤分子标记物,USP10是一种去泛素化酶，它能从特定的蛋白质底物中去除泛素，使蛋白质从蛋白酶体降解中拯救出来[12]。相关研究发现[13]，TM4SF1是泛素化的，泛素化对其在细胞迁移中的功能至关重要。我们先前的研究表明，S100A12的表达与侵袭深度有关，并被评估为GC整体生存率差的独立危险因素。p53和Ki67是癌症进展的既定标志物[14]。在目前的研究中，我们发现TM4SF1的表达与胃癌中USP10、S100A12、p53或Ki67的表达没有相关性，这表明TM4SF1在胃癌侵袭转移中起着不同于USP10、S100A12、p53或Ki67的作用，尽管它们都有助于肿瘤的侵袭和转移。TM4SF1在胃癌侵袭转移中的确切作用值得进一步研究[15]。

在目前的研究中，我们鉴定了TM4SF1的胃组织学定位，发现TM4SF1在正常胃粘膜中呈异质性表达，在胃底粘膜中表达水平较高。而TM4SF1是一种跨膜蛋白，也存在于细胞质中，暂时存在于培养的内皮细胞和肿瘤细胞的细胞核中，并且在肺、乳腺、结肠、卵巢、肾脏的质膜和细胞内小泡中大量表达，前列腺癌和正常血管内皮细胞低表达，TM4SF1在胃组织中的细胞定位尚不清楚。

本研究中，为了探讨胃癌根治术对胃癌患者的治疗效果，对比分析了根治性手术前与根治性手术后1年两组患者的病理特征，结果显示，手术前与手术后胃癌患者的肿瘤Borrmann分型、肿瘤pTNM分期、肿瘤pN分期患者不同分期人数对比差异显著，因此，对位胃癌根治性手术的患者来说，早期治疗，并预测预后胃癌残留具有重要价值。随着临床科学技术的发展，早期胃癌检出率的增加，不仅提升了胃癌的预后情况，同时也为胃癌根治性手术治疗患者提供了更多治疗可能。