Th17、Treg细胞在小儿EB病毒感染中的表达及临床意义

周 洋,陈芳芳,王桂兰,齐曦明,康厚鑫,吴小波*

(1.秦皇岛市第一医院 儿科,河北 秦皇岛066000；2.秦皇岛市第一医院 中心实验室,河北 秦皇岛066000;3.河北北方学院 儿科学,河北 秦皇岛066000)

Epstein-Barr病毒，简称EB病毒(EBV)，是目前儿科临床最常见的感染性疾病之一[1-2]。主要通过唾液传播(亲吻病)，也可通过输血、器官移植等进行传播。儿童中非肿瘤性EBV感染疾病主要包括传染性单核细胞增多(Infectious mononucleosis,IM)、慢性活动性EBV感染(Chronic active EBV infection,CAEBV)、EBV相关噬血淋巴组织细胞增生症(EBV associated hemophagocytosis,EBV-HLH)，后两种疾病是较为严重的EBV感染相关疾病[3-4]。其预后不良，病死率高。必须要引起儿科医师高度重视，来进行临床和实验研究[5-6]。但是，目前我国儿童EBV的流行病学、并发症、临床和实验室检查特征、机体对EB病毒的细胞免疫和体液免疫特点等缺乏系统性研究，而且对EBV相关疾病及重症EB病毒感染的实验室诊断、免疫学研究及相关治疗报道较少。Th17、Treg细胞是近年免疫学研究的热点[7]。有研究表明，其平衡机制及其相关因子(IL-17、TGF-β)的变化，在机体促进清除胞外病原体的入侵和炎症反应中发挥着重要作用[8-9]。为了进一步探索Th17、Treg细胞在EBV儿童中表达的机制，本研究通过对我院EBV感染及健康体检儿童检测EB病毒抗体及EB病毒DNA，统计阳性患儿，分离出外周血T淋巴细胞，进一步采用流式细胞术及ELISA，检测EBV患儿、健康儿童外周血T淋巴细胞中Th17、Treg细胞及其相关特征性细胞因子(IL-17、TGF-β)的水平变化，旨在从分子学水平，对EBV的临床诊断、研究、治疗提供进一步的免疫学支持。从而进一步揭示EBV免疫逃避的形成机制，给儿童EBV的预防及疫苗的开发提供新的思路与方法。

1 资料及方法

1.1 一般资料选取秦皇岛市第一医院2019年12月至2020年8月儿科门诊及病房就诊(复诊)的66例EB病毒感染患儿作为观察组，其中男39例，女27例；年龄6个月-14岁，平均(5.34±0.32)岁；血清EB病毒DNA拷贝数为4.5-6.8×105拷贝数/mL。另外选取同期于我院参加体检的健康儿童60例作为对照组，其中男34例，女26例；年龄1-13岁，平均(5.50±0.38)岁。观察组患儿中，初治组8例，缓解组58例。对照组与观察组在性别、年龄方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 患儿入选标准包括：(1)年龄6个月-14岁；(2)所有EB病毒感染患儿诊断均符合胡亚美等编著的《诸福棠实用儿科学》中的相关标准；(3)包括首发和复发的EB病毒感染患儿；(4)智力正常，无精神类疾病，排除特殊遗传代谢性疾病、血液系统及肿瘤疾病；(5)均依据伦理学原则征得家长及患儿同意，愿意配合本调查。

1.3 实验方法

1.3.1Th17、Treg细胞及其相关特征性细胞因子(IL-17、TGF-β)检测 首先抽取对照组与观察组儿童肘静脉血2.0 mL，将外周血T淋巴细胞加以分离。采用酶联免疫法(ELISA) 和荧光定量PCR 方法检测EB病毒抗体及EB病毒DNA，分析阳性感染率。进一步采用流式细胞术及ELISA，检测外周血T淋巴细胞中Th17、Treg细胞及其相关特征性细胞因子(IL-17、TGF-β)的水平变化，对其进行分析、总结。

1.3.2外周血Foxp3 mRNA表达的检测方法 外周血淋巴细胞采用淋巴细胞分离液进行分离，采用TRIZOL一步法将总RNA加以提取，采用RT-PCR法对Treg表达叉头翼状螺旋转录因子(Forkhead pterygoid transcription factor，Foxp3)mRNA与Th17表达孤核受体(Nosoluclear receptor，RORγt)mRNA的表达水平进行检测分析。基于标准曲线法对mRNA相对表达水平加以计算。

1.4 观察指标比较对照组与观察组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率；比较对照组与观察组Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平；比较初治组与缓解组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平。

1.5 统计学方法采用Excel建立数据库，运用SPSS 19.0统计软件包进行数据录入及统计学分析处理，采用均数、标准差描述一般资料，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率对比观察组外周血Treg细胞百分率显著低于对照组(P<0.01)，观察组外周血Th17细胞百分率显著高于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 两组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率比较

2.2 两组外周血Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平对比观察组外周血Foxp3mRNA表达水平显著小于对照组(P<0.01)，观察组外周血RORγtmRNA表达水平显著大于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 两组外周血Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平比较

2.3 初治组与缓解组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平对比缓解组外周血Treg细胞百分率、Foxp3mRNA表达水平均显著高于初治组(P均<0.05)，缓解组外周血Th17细胞百分率、RORγtmRNA表达水平均分别显著低于初治组(P均<0.01)，见表3。

表3 初治组与缓解组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平比较

3 讨论

EBV感染是目前儿科临床最常见的感染性疾病之一。儿童中非肿瘤性EBV感染疾病严重破坏儿童免疫功能，从而危及患儿生命健康，其预后不良，病死率高[10]。专家提出，儿童EBV感染及相关严重疾病，必须要引起儿科医师高度重视，进行临床和实验研究。

Th17、Treg细胞是目前国内外免疫学研究的热点。研究表明，初始的CD4+T细胞在不同细胞因子的作用下，可以向不同的方向分化。Th17、Treg细胞是一种近年发现的CD4+T细胞新亚型。目前大量研究表明，它们不同于Th1和Th2细胞[11]。最新研究发现，根据人胸腺、扁桃体、淋巴结和外周血中对Th17、Treg细胞的检测，证实Th17细胞可通过特征性分泌IL-17诱导粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、前列腺素E2及其他一些炎症因子的表达产生强烈的致炎效应，参与各种自身免疫病、器官移植排斥反应和寄生虫感染等多种疾病的促炎症反应[12]。而Treg细胞是通过表面膜分子Foxp3，与其他细胞直接接触或分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β等方式，来抑制体内的CD4+T细胞等多种免疫细胞的活化和增殖。有研究表明，其平衡机制及其相关因子(Th17、TGF-β)的变化，在机体促进清除胞外病原体的入侵和炎症反应中发挥着重要作用[13-14]。目前和自身免疫性疾病、肿瘤、抑制免疫和寄生虫感染性疾病的免疫调节密切相关。目前国内儿童EBV感染中，机体对EB病毒的细胞免疫和体液免疫特点、合发症的发生率等还缺乏系统研究，需要多中心协作研究。因此，研究国内儿童EBV感染中Th17、Treg细胞及其相关因子(Th17、TGF-β)的变化具有重要意义。

本研究结果还显示： 观察组外周血Treg细胞百分率显著低于对照组(P<0.01)，观察组外周血Th17细胞百分率显著高于对照组(P<0.01)；观察组外周血Foxp3mRNA表达水平显著小于对照组(P<0.01)，观察组外周血RORγtmRNA表达水平显著大于对照组(P<0.01)。张茜等[15]研究发现：机体免疫反应之中，IL-6对Th17细胞以及Treg细胞之间的平衡性能够有效调节，且该因子能够决定初始CD4+T细胞的分化方向，对机体的免疫应答效应产生一定的影响。据此，可以推测在EBV感染疾病患者中，EBV靶细胞T淋巴细胞以及NK细胞等功能存在较大的缺陷，且会使得EBV清除过程受阻，某些细胞因子加快Th17细胞的增殖速度，引起炎性级联扩大效应出现，Treg细胞增殖过程受到抑制，从而削弱了其抑制T淋巴细胞过度活化效果。上述结果就表明：Treg细胞所介导的免疫耐受在EBV感染的相关疾病的进展过程中扮演着十分重要的角色。此外，强化对外周血Treg细胞数及其相关炎性因子进行动态化监测，能够对EBV感染的相关性疾病的临床治疗效果进行准确地评估。

综上所述，Treg/Th17细胞在EBV感染的相关疾病发病过程中扮演重要的角色，强化对患儿外周血Treg/Th17细胞水平的监测，能够为EBV感染相关性疾病病情及临床治疗效果评估提供重要依据。