抗菌肽裂解法联合环介导等温扩增技术检测尿沙眼衣原体的研究

苏真娟,王梦涛

(盘锦市中心医院 检验科微生物室,辽宁 盘锦124010)

沙眼衣原体是一种传播广泛的胞内寄生病原体，最常见于有不洁性生活史的青年人[1]。由于感染者初期多无症状，使得沙眼衣原体感染的诊断较为困难[2]。为避免其引起的附睾炎和前列腺炎进而影响男性生育功能，对沙眼衣原体感染的早期诊断变得十分重要[3]。目前诊断沙眼衣原体感染的金标准是基于PCR的核酸扩增技术，尽管该技术具有高度的特异性和敏感性，但耗时长，需要复杂和昂贵的实验室设备[4]。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型、高灵敏度和特异性的诊断工具，其易于操作且耗时短，不需要复杂和昂贵的PCR热循环仪，已成为新一代具有潜力的诊断方法[5]。然而，尿液标本的检测需要事先裂解并从病原体中提取RNA，目前病原体细胞裂解液制备技术大多复杂而耗时，并且需要完全集成的自动化平台[6]。近年的研究表明抗菌肽作为一种非常有效的支原体裂解剂，可在等温扩增前作为快速有效的样品制备剂[7]。因此，本研究拟将LAMP技术与抗菌肽裂解法相结合，从而快速、灵敏地检测人尿中的沙眼衣原体。

1 研究方法

1.1 临床标本采集选取盘锦市中心医院2019年12月至2020年06月接受尿液衣原体检测的患者100例，患者年龄18-33岁，女性44例，男性56例，排除抗生素使用史及细菌感染患者，由患者自行收集清晨第一次尿液样本20-25 ml到清洁聚丙烯小皿中，并且在1天内接受检测。根据我院常规采用沙眼衣原体(CT)/淋球菌(NG)质控试剂盒(罗氏诊断产品(上海)有限公司)以定量PCR法检测沙眼衣原体感染。

1.2 引物设计和筛选选择沙眼衣原体隐性质粒作为目的基因，使用在线引物比对工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)及LAMP引物设计软件LAMP Designer 1.10设计沙眼衣原体特异性LAMP引物及环状引物以加快扩增时间，提高灵敏度。并且使用Oligo Analyser tool对引物进行复筛，引物设计原则：引物对DNA位点有较高的敏感性，环状引物上没有非特异性背景，尽量避免含有易形成二级结构、发夹或分子相互作用的序列并且综合Tm 值、△G 值、GC 含量等参数。最终得到了LAMP引物6条，由上海生工生物工程有限公司合成，采用生物素标记引物FIP和LF的5’末端，采用FAM标记BIP和LB引物的5’末端，见表1。

1.3 抗菌肽样本预处理每30 μl尿液样本中加入4 μl 1×抗菌肽裂解液(德国SelfD生物技术有限公司)后在90℃下预热5 min，然后置于冰上冷却，取5 μl裂解物用后续实验，另取5 μl未作裂解处理的尿液作为对比。

1.4 实时荧光 LAMP反应使用LAMP反应试剂盒(海研拓生物科技有限公司)，反应为40 μl体系，其中包括5 μl裂解后或未处理的尿液、2×LAMP反应Mix10 μl、25 mM MgCl23 μl、8 U/μL Bst DNA聚合酶1.5 μl、0.5 μl SyberGreen荧光染料、0.3 μl ROX(美国赛默飞生物科技有限公司)和引物(见表1)；引物的终浓度分别为FIP/BIP 0.8 μM，F3/B3 0.2 μM，LF/LB 0.4 μM，然后补水至40 μl。使用Applied Biosystems 7900HT(美国赛默飞生物科技有限公司)实时PCR系统进行反应，反应温度为 64 ℃，每循环1 min，共40个循环，重复3次，每次实验均以双蒸水为模板作为阴性对照。

表1 引物信息表

1.5 特异性实验以6种其他的常见菌株(大肠埃希菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、副溶血链球菌)作为特异性检测实验，检测有无非特异性扩增曲线。使用 BHI 固体培养基(Oxoid 公司)培养上述菌株后挑取单菌落用核酸快速提取试剂盒(QIAGEN公司)提取DNA用于 LAMP 扩增检测，反应条件中将5 μl尿液替换为1.2 μl DNA模板，其余条件同上，每一样本重复3次。

1.6 灵敏性实验取步骤4中的PCR产物，采用UltraPureTMAgarose(美国赛默飞生物科技有限公司)进行核酸电泳纯化后检测DNA浓度并且根据产物长度计算基因拷贝数，据此进行浓度梯度稀释再进行 LAMP 反应灵敏性实验。

1.7 临床验证实验以PCR荧光法检测作为金标准评估LAMP实验的临床性能，以灵敏度、特异度、准确度及一致率作为真实性评价指标，灵敏度为LAMP实验阳性人数在金标准(PCR荧光法)阳性人数中所占比例，特异度为LAMP实验阴性人数在金标准阴性人数中所占比例，准确度为灵敏度+特异度-1，一致率为两种方法结果一致(均为阳性或阴性)人数在总受试对象中所占比例。

2 结果

2.1 LAMP反应

与未接受抗菌肽裂解处理的尿液样本相比，裂解后样本反应效率大幅提高，10循环左右即可达到平台期，见图1。

图1 尿样沙眼衣原体隐性质粒LAMP扩增曲线

A 未接受抗菌肽裂解处理的尿液样本的LAMP扩增曲线 B接受抗菌肽裂解处理的尿液样本的LAMP扩增曲线

2.2 特异性实验

测试所用6种常见病原菌在LAMP扩增实验中均未出现特异性曲线，仅沙眼衣原体样本出现了特异性扩增，可见沙眼衣原体与其他病原菌在LAMP实验中无交叉反应，见图2。

图2 尿样沙眼衣原体隐性质粒LAMP扩增特异性实验

2.3 灵敏性实验

将 LAMP实验所得产物纯化后，测得DNA浓度为 45.66 ng/μL。将其稀释至 10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个浓度梯度进行 LAMP 实验，按10循环计算对应模板量为 4.46×10-7、4.46×10-8、4.46×10-9、4.46×10-10、4.46×10-11ng/μL。随着模板浓度降低，到达平台期的循环数增加，但在4.46×10-11ng/μL模板浓度下仍能在25循环左右到达平台期完成LAMP扩增，见图3。

图3 尿样沙眼衣原体隐性质粒LAMP扩增灵敏性实验

2.4 临床验证实验

100例受试者中，经医院定量PCR法测定沙眼衣原体阳性42例，未经裂解肽处理的尿样LAMP实验敏感度、特异度、准确度及一致率均低于抗菌肽裂解联合LAMP实验法，见表2。

3 讨论

人群中沙眼衣原体感染率高达12.3%-17.4%，而其可导致多种泌尿生殖道疾病发生，早期诊断对沙眼衣原体感染的有效干预十分重要[8]，而人尿成分复杂，其中多种成分会影响扩增反应的效率。例如，尿液中的尿素会导致聚合酶降解[9]。因此，PCR技术检测尿液标本时除昂贵费时等缺点外还极易受到尿液中其他物质的干扰以致结果失准。LAMP技术通过设计一组靶基因特异性引物，其可以自身重复发生链置换合成反应，从而在恒温条件下实现核酸的快速扩增，不需PCR技术所依赖的温度循环设备[10]。而在LAMP实验中引入抗菌肽裂解步骤，可以提高直接从尿样中检测沙眼衣原体的能力，而无需事先提取、纯化和浓缩病原体遗传物质[11]。

表2 尿样沙眼衣原体隐性质粒LAMP扩增真实性实验(n,%)

在本研究中，我们选择沙眼衣原体隐性质粒作为扩增目的基因，隐性质粒是沙眼衣原体中一种相对稳定的核酸靶点，相比基因组DNA更能抵抗核酸酶的损伤，且其在基因组中至多可有10个拷贝，相比单拷贝基因敏感度更高[12]。在LAMP反应中至少应有一对外游引物(F3/B3)及一对内游引物(FIP/BIP)，我们的研究中增加了一对环引物(LF/LB)，相比之前的报道具有更高的特异性，而且可以加快扩增时间[13-14]。更重要的是，先前王雪亮及李若琳等人的研究均需在体外实现提取样本沙眼衣原体中的遗传物质并进行浓缩纯化，目前关于使用LAMP技术直接在临床样本中进行检测的报道十分有限。抗菌肽已被证明是一类高效的抗菌剂，其通过识别感染衣原体细胞表面的高负电荷密度并形成特殊二级结构插入到脂质双分子层中穿透细胞膜进而裂解病原体[15]。我们的研究创新性地在LAMP扩增前使用抗菌肽来释放衣原体DNA从而快速有效制备待检样本。由于不需事先提取和纯化DNA，使得整个检测过程变得简单而省时。传统PCR定量技术需要60 min左右的扩增时间，而联合抗菌肽裂解法的LAMP扩增仅需十余分钟即可达到平台期，由于直接使用尿液样本难以避免其他微生物的干扰，我们设计了特异性实验，使用了6种常见病原菌来测试使用该方法检测沙眼衣原体与其他病原菌的交叉反应，结果显示其特异性良好，不会受到杂菌污染的影响。敏感性实验中即使模板DNA被稀释10-9倍反应仍能在25循环左右到达平台期，可见本方法稳定性良好，不容易受到样本稀释的影响。临床样本的真实性实验中未经裂解肽处理的尿样LAMP实验敏感度、特异度均在74%左右，可见未经裂解及DNA富集的LAMP实验检测效能欠佳，而抗菌肽裂解联合LAMP实验法的敏感度、特异度提高至83.3%及86.2%，一致率达85.0%，可以实现尿液衣原体快速且高效检测，尤其是在大规模人群筛查中极具优势。后续有待进一步扩大样本的检测量以进一步验证其检测效能及稳定性。

联合抗菌肽裂解法的环介导等温扩增技术能实现尿液沙眼衣原体的快速检测，且特异度、灵敏度及临床性能较好，具有一定临床应用前景。