双氢青蒿素对TGF-β1诱导的子宫内膜间质细胞分泌MMP-9和TIMP-1的影响

栗志英，马景红*，齐秀芳，单铁英，杨志红，马瑞晴，魏天慧，董付存，张素华

(1.河北工程大学 a.附属医院；b.医学院，河北 邯郸056002；2.邯郸市第一医院 a.血液科；b.儿科；c.神经内科；3.邯郸市中心医院门诊部)

近几年来，逐渐增多的生育期妇女不能孕育胎儿，通过妇产科检查发现其中多数人的子宫内膜表现为粘连且纤维化病变，此种改变较难治愈且复发率较高，故成为相关医学专家研究的焦点。至今子宫内膜粘连且纤维化的发病机理尚没有明确的定论，大量的文献研究表明，转化生长因子-β1(TGF-β1)能刺激多种器官的组织中间质细胞的不仅数量增加而且活性增强，因此使细胞外的纤维和基质成分异常增多[1-4]，如果不采取有效的干预或治疗方法，最终将会导致该器官呈现出纤维化的改变。本文通过体外分离人子宫内膜中的间质细胞，观察双氢青蒿素(DHA)对TGF-β1作用的间质细胞数量以及分泌功能的变化，为子宫内膜纤维化的逆转提供一个新的启示。

1 材料与方法

1.1 材料

正常子宫内膜组织的来源：选出2019年6月1日—2019年月12月31日在邯郸市第一医院妇科门诊就诊，近半年内无激素用药史的生育期患者，留取手术室中刮出的内膜组织，立即放入4℃的孵育液中，该组织经病理检查为正常组织且处于增生期。

DHA、TGF-β1(广州源生医药科技有限公司)；MMP-9、波形蛋白和TIMP-1抗体(南京安研生物)；SP检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1分离出内膜组织中的间质细胞 将内膜组织剪碎为小颗粒状，滴入适量消化酶，在37℃的震荡箱中作用30 min，筛除尚未消化的颗粒，将含有细胞的消化液置于半径为6 cm的离心仪中，设置转速600 r/min，时间10 min，留下悬浮液，再于1 200 r/min，离心10 min后，沉淀中加入有血清的培养液后常规条件下进行培养，分别观察活细胞以及染色后的细胞形态结构，滴加抗体鉴别细胞的种类。

1.2.2检测间质细胞的增殖情况 将细胞放入一个设有96个孔的细胞培养板里，将6个孔安排为一组，每个孔滴加200 μl的含有细胞浓度为5×104个/ml的培养液，共设置为4组，对照组：按照常规方法培养；DHA组：常规培养液中滴入DHA；TGF-β1组：常规培养液中滴入TGF-β1；TGF-β1+DHA组：常规培养液中滴入TGF-β1和DHA。滴加TGF-β1、DHA后其在培养液的含量分别为100、20 ng/ml。将其经常规培养48 h后，各孔均滴入噻唑蓝溴化四唑重新孵育4 h，可见孔底有蓝紫色结晶，板的孔向下放置在滤纸上，孔里的培养液被吸干净后，滴加二甲基亚砜100 μl避光并轻震直到结晶消失，放在检测仪里，读取它们的吸光度数值。

1.2.3检测细胞培养液中Ⅰ型胶原的含量 细胞的分组情况同1.2.2，每组细胞孵育48 h后，吸取培养液分别放入4个试管中，按照酶联免疫试剂盒的操作流程测出4组细胞分泌的Ⅰ型胶原的含量。

1.2.4检测间质细胞内MMP-9和TIMP-1含量 将细胞放入一个6个孔的板里，每个孔的底部放置盖玻片，细胞的分组情况同1.2.2，细胞孵育48 h后，这时片上已经长满细胞，将其取出后放入固定液中，按照细胞免疫化学染色的操作步骤，第一抗体分别为稀释度为1∶500的MMP-9和TIMP-1的抗体，最后滴加二氨基苯联胺对每组细胞内的MMP-9和TIMP-1蛋白进行显色，通过图像分析系统读取间质细胞质里棕黄色的颗粒的吸光度值，最后计算出每组的平均吸光度值来衡量细胞中MMP-9和TIMP-1蛋白的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 观察间质细胞的形态结构

刚从内膜组织中分离的间质细胞形状为圆形，放入培养瓶中常规培养1天后就能紧贴瓶底。3天时可见细胞长大，爬满瓶底，染色后可以清晰看出细胞向四周伸出长短不一的突起，蓝色的单个核居中。见图1A、1B。经波形蛋白抗体特异性的结合后，胞质大部分颜色为棕黄色，见图1C。

2.2 间质细胞的增殖分析

对照组与DHA组的吸光度值相比无明显差异(P>0.05)；TGF-β1组的吸光度值和对照组比较，其值显著升高(P<0.05)；TGF-β1+DHA组与TGF-β1组相比，细胞的吸光度值明显下降(P<0.05)，见表1。

表1 间质细胞的增殖和分泌活性的分析

2.3 细胞培养液中Ⅰ型胶原的分泌情况

对照组与DHA组的Ⅰ型胶原含量相比无明显差异(P>0.05)；TGF-β1组与对照组比较，Ⅰ型胶原在培养液中的量明显升高(P<0.05)；TGF-β1+DHA组与TGF-β1组相比，Ⅰ型胶原的含量明显下降(P<0.05)，见表1。

2.4 间质细胞内MMP-9和TIMP-1蛋白的含量分析

对照组与DHA组胞质内两种蛋白含量相比无明显差异(P>0.05)；TGF-β1组细胞内MMP-9的含量稍微高于对照组，经统计无明显差异(P>0.05)，TIMP-1的含量超过对照组(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值小于对照组(P<0.05)。TGF-β1+DHA组细胞内MMP-9的含量明显超过TGF-β1组(P<0.05)，TIMP-1的含量明显少于TGF-β1组(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值大TGF-β1组(P<0.05)，见图2，表1。

注：TGF-β1—转化生长因子-β1；DHA—双氢青蒿素；MMP-9—基质金属蛋白酶-9；TIMP-1—基质金属蛋白酶抑制剂-1

3 讨论

宫腔粘连或纤维化是指靠近子宫腔面的子宫内膜组织发生了纤维化，纤维化的组织容易粘连在一起使宫腔局部或全部消失，通过宫腔镜可以看见，纤维化的组织失去了正常质软和红润的颜色，变得色白且质硬[5-7]。病理组织学检查，纤维化的部位表面没有上皮组织，只有纤维成分较多的结缔组织[8]。影响子宫内膜纤维化发生、发展的因素较多，作用机理也比较复杂，其最终的作用结局是正常的内膜组织被纤维成分较多的结缔组织代替。医学研究表明，在为数多种的导致纤维化的因子中，TGF-β1的作用较为重要。实验证明，它在心脏[9]、肾脏[10]、肺脏[11]以及肝脏[12]等人体的多种器官组织的纤维化的发生和发展中均扮演者重要的角色。归纳其作用机理：第一，它能刺激组织中的间质细胞数量增多，并能增强其分泌胶原纤维等基质成分到细胞外；第二，在它的刺激下，上皮细胞转化为能分泌基质成分的间充质细胞；第三，它还能影响分解细胞外成分的酶—MMPs和它的特异性拮抗剂TIMPs的含量，使基质金属蛋白酶的量增加，而其抑制剂的含量降低。已经有研究已经证明，TGF-β1和MMP-9在子宫内膜纤维化的所起作用[13-14]。

MMPs共有5种亚型，均能特异性地分解细胞外基质中的组成成分，其中MMP-9，可以专门作用于Ⅳ、Ⅴ型胶原以及纤纤维连接蛋白等。TIMPs共有4种亚型，其作用与MMPs的作用相反，TIMP-1是MMP-9的拮抗剂[15-16]。在正常的组织器官里，二者的水平维持着基质中某些成分的平衡，当组织中MMP-9/ TIMP-1 的值下降时，基质中的Ⅳ、Ⅴ型胶原以及纤纤维连接蛋白等成分含量就会过多，组织就会出现纤维化。

青蒿素为众所周知的抗疟疾的药物，双氢青蒿素(DHA)是它的一种衍生物，文献报道DHA的药理学作用较多，它具有改变免疫系统的活性、消灭肿瘤细胞以及降低炎症反应等[17-19]。近年来也有研究显示，青蒿琥酯通拮抗肝组织内的星状细胞的数量和活性来减轻其组织的纤维化进程[20]。本研究的体外培养细胞实验表明，对照组的子宫内膜细胞中含有微量的MMP-9和TIMP-1，经TGF-β1刺激的细胞中MMP-9的水平虽有所上升，但经统计显示二者没有差异(P>0.05)，TIMP-1的水平比对照组明显增加(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值比对照组减少(P<0.05)。TGF-β1+DHA组的细胞中MMP-9的水平比TGF-β1组明显上升(P<0.05)，TIMP-1的的水平比TGF-β1组明显下降(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值比TGF-β1组增加(P<0.05)。因此得出，导致子宫内膜纤维化改变的原因不能简单的定义为MMP-9的降低以及TIMP-1水平的上升，而是要看这两种酶的比值的波动情况，即TIMP-1水平上升的值能全部抵消MMP-9水平增高所带来的间质成分增加的后果。向经TGF-β1细胞培养液中加入DHA 后，MMP-9水平明显上升但是TIMP-1水平明显下降，MMP-9/TIMP-1的比值上升，也就是说TIMP-1的功效相对降低，MMP-9的溶解间质成分的能力相对增强，可以起到抑制子宫内膜纤维化的效果。