基于“毒瘀交阻”探讨金果胃康胶囊对PLGC大鼠Wnt/Lgr5通路调控的影响 *

宋健 袁敏惠 刘争辉 崔冰慧 褚宇鹏黄毓娟 惠建萍 沈舒文 于勇 孟凯强

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安市中医医院，陕西 西安 712021)

胃癌前病变(PLGC)是指胃黏膜出现肠上皮化生、异形增生的病变，可恶变为胃癌，而胃癌的死亡率位居全球第三位[1]，也是我国常见一种恶性肿瘤疾病。胃癌的发病机制目前尚不清楚，近年来更多的研究者认为，胃癌的发生在于胃癌干细胞的存在和信号通路的异常表达，其中典型代表为Wnt/β-catenin信号通路，Lgr5作为Wnt/β-catenin通路的受体蛋白，也被大家认为是众多恶性肿瘤干细胞潜在的分子标记物[2-6]。

本课题组在前期临床和实验研究的基础之上，研究基于“毒瘀交阻”理论组方金果胃康胶囊对胃癌前病变大鼠模型Wnt/Lgr5信号通路调控的分子机制。

1 材料

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠90只,体重100～130 g，4～5周龄，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(川)2015-030。

1.2药物与试剂 N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)由日本东京化学工业有限公司生产提供，编号：MO527；盐酸雷尼替丁，货号：S67363；4%的多聚甲醛溶液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，武汉博士德；RNA提取试剂盒、cDNA反转试剂盒、荧光定量试剂盒，深圳艾伟迪；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；无水乙醇；二甲苯；Wnt1、β-catenin、Lgr5、β-actin，单克隆抗体，北京博奥森。金果胃康胶囊(产品批号：20190429)由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供；维酶素片(产品批号：20190104，国药准字H41024448)规格：0.2g×100片，由乐普恒久远药业有限公司生产。

1.3主要仪器 702超低温冰箱，美国Thermo；TC-120 S+型生物组织自动脱水机，湖北泰维；B ETS-M5脱色摇床，江苏Kylin-bell；5430R高速低温离心机，德国Eppendorf；全自动高压灭菌器，日本Sanyo；FC3化学发光凝胶成像系统，美国Protein Simple；CX21正置电子光学显微镜，日本OLYMPUS；R 136型石蜡切片机，德国Leica；TK-218生物组织摊片机、烤片机，湖北泰维；C150酶标仪，美国Biotech；紫外分光光度计：Thermo公司，Nano Drop2000。

2 方法

2.1模型复制、分组及给药 在实验室适应性喂养1周后，把90只大鼠随机抽取12只(空白组)，对于剩余78只大鼠进行复制PLGC模型。空白组正常喂养，造模各组采用浓度为150 ug·mL-1的MNNG溶液自由饮用，结合饥饱失常、浓盐水灌胃法[7]，直到17周末，病理切片确定造模成功，将造模成功的60只大鼠随机分为5组。空白组及模型组大鼠每日生理盐水灌胃；维酶素治疗组大鼠按照0.068 g·mL-1浓度灌胃，金果胃康胶囊高、中、低剂量治疗组大鼠分别按照0.096 g·mL-1、0.048 g·mL-1、0.024 g·mL-1浓度灌胃；以上灌胃均采用3 mL·只-1，每日1次。连续灌胃治疗6周。

2.2取材 第23周末灌胃治疗结束，禁食不禁水12h后处死，取大鼠胃小弯体-窦交界处黏膜组织。

2.3蛋白免疫印迹法检测 采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Wnt/Lgr5信号通路靶因子Wnt1、β-catenin、Lgr5表达水平。提取大鼠胃粘膜组织总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转膜，10%的脱脂奶粉封闭1 h，滴加稀释后的一抗，4℃左右慢摇过夜。用TBST室温下摇床上洗5 min×3次，加稀释后的二抗，缓慢摇动，室温下孵育1h，之后用TBST洗5 min×3次，用图像分析仪进行曝光，ECL试剂显影成像。PhotoShop整理去色，ImageJ软件处理系统分析目标条带的灰度值。

3 结果

3.1一般情况 造模前各组大鼠在体重方面比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模成功后造模组大鼠与空白组大鼠体重方面比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 造模前后空白组与造模组体重比较

治疗前与空白组相比，模型组及各药物治疗组大鼠体重下降明显，差异有统计学意义(P<0.01)；治疗结束后与模型组相比，治疗组大鼠体重均增长，差异有统计学意义(P<0.01)，其中空白组及中药高、中剂量组、维酶素组大鼠体重增长明显。见表2。

表2 药物干预前后各组大鼠体重比较

3.2大鼠胃黏膜病理改变情况

3.2.1HE染色和AB-PAS染色光镜下观察 模型组、各个治疗组大鼠胃粘膜病理变化较空白组严重；治疗组病理变化较模型组改善明显，其中金果胃康胶囊中剂量治疗组改善最为明显。说明药物干预后大鼠胃黏膜肠上皮化生的病变程度有所减轻，其中尤以金果胃康胶囊中剂量组效果最为显著。

3.2.2免疫印迹法检测 采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Wnt/Lgr5信号通路靶因子Wnt1、β-catenin、Lgr5表达情况。

3.2.2.1蛋白显影情况 应用Western bloting法检测Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白在各组织标本中的表达。结果可见Wnt1、β-catenin、Lgr5条带在模型组中的表达均增多，在各药物治疗组表达均有所减少。见图1。

图1 Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表达情况

3.2.2.2蛋白定量表达分析 与空白组相比，模型组Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表达量均明显升高，有统计学意义(P<0.01)。

与模型组相比，中药中、高剂量组、维酶素组Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表达量均显著下降，有统计学意义(P<0.01)。实验结果表明一定浓度的金果胃康胶囊可能通过降低Wnt1、β-catenin、Lgr5的蛋白及基因转录从而抑制了Wnt/Lgr5信号通路的表达，在一定程度上抑制胃肿瘤干细胞的过度增殖、迁徙、凋亡，从而起到预防甚至逆转PLGC进一步发展的作用。详见表3，图2，图3，图4。

表3 各组大鼠胃黏膜组织Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白的相对表达量

图2 各组大鼠胃黏膜组织Wnt1蛋白定量表达

图3 各组大鼠胃黏膜组织β-catenin蛋白定量表达

图4 各组大鼠胃黏膜组织Lgr5蛋白定量表达

4 讨论

4.1胃肿瘤干细胞及Wnt/Lgr5信号通路与胃癌

Lgr5+是胃癌干细胞生物标志物之一，正常情况下，Lgr5+细胞局限于胃窦腺体基底部[5,8]。在各种病理因素的作用下，导致干细胞最终转变为肿瘤干细胞。Lgr5+胃癌干细胞的异常增多和侵袭迁移是肿瘤发生的早期事件，肿瘤干细胞和干细胞存在共同调节的信号通道(包括经典Wnt，Notch，Sonic，hedgehog通道)，作为Wnt信号通路的靶基因，Lgr5+高表达参与胃癌增殖、侵袭、转移[9-12]。

4.2“毒瘀交结”理论与金果胃康胶囊[13-19]我校沈舒文教授科研团队在长期的临床医疗实践中，根据PLGC的中医证候特征，创新性提出“毒瘀交阻胃络”是胃癌前病变的核心病机。沈舒文教授认为：胃癌前病变是在感染毒邪之后，出现气滞、血瘀，进而气滞、毒结、血瘀三者互结，其“毒瘀交阻”损伤胃络，致胃黏膜腺体萎缩，肠上皮化生或不典型增生，“毒瘀交阻”既是胃癌前病变的病理产物，又是胃癌发生的直接病因，毒可致瘀，瘀可致毒，两者互为因果、相互加重病情，尤其是重度非典型增生及肠化阶段以“毒瘀交阻”证为主，这一阶段是发展成为胃癌的关键环节。虽然本病在临床也可见到“气阴两虚、脾胃亏虚”正气不足的一方面，但是更多的兼见有“气滞、血瘀、毒壅、湿阻”邪气实的一方面存在，而且正气虚往往是因于“气滞、血瘀、毒壅”邪气实而致正气虚。毒附于瘀而难于清解疏达，瘀附于毒而难于气血疏通。因而我们在临床治疗过程中，始终应以“毒瘀交阻”为最关键病机，扶正同时兼治毒瘀，给予解毒化瘀。解毒方法主要为清化湿热，以清除Hp为主要目的；化瘀法当消散胃络凝瘀。

沈舒文教授基于中医药理论、立足临床实践结合现代科学研究成果，研制出金果胃康胶囊，本方组成包括太子参、半枝莲、枸橘、朱砂七，于2006年制成陕西中医药大学附属医院院内制剂，通过前期临床观察发现：对于“毒瘀交阻兼见气阴两虚”证型的胃癌前病变临床治疗效果显著。

本研究发现金果胃康胶囊可以改善PLGC大鼠的一般情况和胃黏膜的病理变化情况，同时还可以降低大鼠胃黏膜组织中Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表达及基因转录水平。提示金果胃康胶囊可抑制胃癌干细胞Lgr5+分子标志物过度表达，可能作用机制是通过抑制Wnt信号通路的活化，逆转或延缓胃癌的发生、发展。