3个栾树品种抗寒性比较及生理指标变化

刘金秋,曹帮华，任永俊，王世栋，段正洪，高 莉，王桂苓，孙丰胜

（1.山东省地质科学研究院，山东济南250013；2.山东农业大学 黄河下游森林培育国家林业和草原局重点实验室，山东泰安271001；3.淄博市沂源县历山街道办事处，山东淄博256199；4.五莲县洪凝街道办事处，山东日照262300；5.滕州市国有西岗苗圃，山东滕州277519；6.山东省国土空间规划院,山东济南250014；7.东平县林种苗圃管理服务中心，山东东平271509）

栾树又名灯笼树，原产于我国中、北部地区，主要在江苏、浙江，安徽、江西、河南大量种植，近年来在山东省城市绿化中广泛应用。栾树为无患子科栾树属落叶乔木或灌木，为深根性植物，生长速度中等，树形优美，枝叶茂盛，是庭园遮荫树的良好树种； 春季叶子幼嫩多呈红色，夏季开满黄花，到秋天叶色开始变黄，长出似灯笼的紫红色果实，具有极高的观赏价值；常作为优良行道树及园林景观品种[1]。我国冬季低温区域广泛且差异较大，北栾在北方具有广泛适应性，南栾在北方由于低温原因，限制了其推广应用，开展南栾抗寒良种选育及抗寒性研究对树木引种栽培及选育具有重要意义。

目前栾树抗逆性研究方面涉及抗旱性、抗寒性、抗滞尘、抗SO2等[1-5]，树种间比较较多，栾树品种间比较较少。王珊珊[1]、冯献宾[2]、王岩[6]等对栾树与其他树种抗寒性进行了比较研究,但关于栾树品种水平上的抗寒性研究很少。

低温是限制植物分布和园林应用的重要环境因子。采用人工冷冻处理测定植物抗寒生理指标的变化来揭示和研究植物的抗寒性是目前较为常用的研究方法。本文以引种驯化选育的南栾优良无性系 “滕选”4 号、5 号为研究对象，采取低温胁迫方法，研究了2 个无性系抗寒性及其低温胁迫下相关生理生化指标的变化并与北栾进行了比较,以期为栾树良种选育及推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年12月下旬采集位于山东滕州市西岗国有苗圃栾树“滕选”4 号、5 号及北栾长势基本一致、无病虫害、木质化良好的1年生枝条，在0℃至4℃储存待测。

1.2 研究方法

1.2.1 试验设计

低温处理方法参照曹晓敏[9]等的方法，将采集的供试枝条用去离子水冲洗干净，用吸水纸吸干，剪成15～20 cm 的枝段，用石蜡封闭剪口，按照品种贴标签，装入自封袋，放入可控超低温冰箱。依次设-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃共6 个处理温度，以-5℃为对照。待冰箱降至设定温度后保持12 h，取出第一批试材，并继续将冰箱降至下一设定温度后保持12 h,取出下一批试材，依次进行。将取出的试材在4℃环境下解冻12 h，测定电导率。在-5 ～-25℃之间测定超氧化物歧化酶 （SOD）、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）的变化。每个指标重复测定3 次。

1.2.2 指标及测定方法

（1）相对电导率测定[3]

将处理后的枝条剪成0.1～0.2 cm 的小段（去除芽）。称取0.5 g 放入试管中，加入40ml 去离子水在室温下浸泡12 h 后待测。测定浸泡液的电导率S1，再将盛有浸泡液的试管置于沸水浴30 min,冷却至室温后测定浸泡液电导率S2，相对电导率＝（初电导值/终电导值）×100%。

（2）半致死温度计算

通过Logitic 回归方程y ＝k / (1+ae-bx),计算半致死温度。其中:y 为相对电导率,x 为处理温度、k 为细胞伤害率的饱和容量,a,b 为曲线方程的参数[11]。根据王国霞[12]等的方法,将k 设为100%,计算得出a、b 和决定系数R2的值,处理温度与相对电导率曲线的拐点温度，即为半致死温度LT50＝lna / b。

（3）生理生化指标测定

采用氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶(SOD)、酸性茚三酮法测定脯氨酸、蒽酮比色法测定可溶性糖、考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白、硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛( MDA)[13]。

1.2.3 数据的处理与分析

利用Excel 软件进行数据归整理、作图，SPSS 20.0 软件对试验数据采用单因素方差分析，邓肯（Duncant）方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下相对电导率的变化及半致死温度

低温胁迫下相对电导率的变化见图1，低温胁迫下，3 个栾树品种的相对电导率都呈不断上升趋势总体呈S 型曲线。。各品种电导率变化显著，其中北栾增加幅度最小为88.69%（P＜0.05）,4 号增加幅度最大为194.08%（P＜0.05），5 号增加幅度居中为89.80%（P＜0.05）。

图1 低温胁迫下不同栾树相对电导率的变化/ %

根据3 个栾树品种在低温胁迫下相对电导率的变化，通过Logistic 拟合回归方程y＝k/(1+ae-bx),计算得出各品种的半致死温度（LT50）见表1，栾树各品种拟合相关系数的R2均在0.9 以上，拟合度较高。各品种的低温半致死温度表现出差异性，北栾低温半致死温度最低为-27.549℃，其次为 “滕选”4 号-20.895℃，最高为“滕选”5 号-18.723℃。3个栾树品种抗寒性排序为北栾＞“滕选”4 号＞“滕选”5 号。

表1 3 个栾树品种的半致死温度

2.2 低温胁迫下抗氧化酶SOD 活性的变化

随着胁迫温度的降低，栾树各品种的SOD 含量如图2所示，都呈先降低再升高再降低趋势。其中，“滕选”4 号、5 号在-5～-10℃不断降低，-10～-20℃后上升，北栾在-5～-15℃不断降低，-15～-20℃后上升，所有栾树SOD 含量在-20℃快速上升后降低。“滕选”4 号、5 号、北栾SOD 含量最高比最低分别增加了108.26%（P＜0.01）差异极显著、81.56%（P＜0.01）差异极显著、31.22%（P＜0.05）差异显著。

图2 低温胁迫下不同栾树品种SOD 活性的变化/(U·g-1)

2.3 低温胁迫下渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的变化

随着胁迫温度的降低，栾树各品种的脯氨酸含量如图3所示，“滕选”4 号、5 号呈先降低后升高趋势，北栾则不断升高。“滕选”4 号、5 号在-10℃前有所下降，-15℃后都持续升高，-15～-25℃之间增加缓慢，而北栾在-5～-10℃增加缓慢，-10～-15℃之间增加迅速，-15～-25℃之间增加缓慢，可能与-15℃之前北栾所受损伤低于“滕选”4 号、5 号，脯氨酸含量偏低，随着伤害加重，脯氨酸含量急剧增高。“滕选”4号、5 号分别比对照增加了136.56%（P ＜0.05）、129.01%（P＜0.05），差异显著，北栾比对照增加了320.16%（P＜0.01），差异极显著。

图3 低温胁迫下不同栾树品种脯氨酸含量的变化/(mg·g-1)

低温胁迫下，栾树各品种的可溶性糖含量变化如图4所示，随着低温胁迫的加剧，“滕选”4 号、5号可溶性糖含量均呈先上升后下降趋势，在-20℃含量高于其他胁迫温度。北栾可溶性糖含量呈不断升高趋势。其中，在-5～-20℃低温处理阶段内，所有品种可溶性糖含量都呈上升趋势，在-20～-25℃“滕选”4 号、5 号缓慢下降而北栾迅速增加，“滕选”4号、5 号、北栾相比较对照分别增加了211.18%（P＜0.01）、99.37%（P＜0.01）、112.21%（P＜0.01），均差异极显著。

图4 低温胁迫下不同栾树品种可溶性糖含量的变化/（mg·g-1）

低温胁迫下，栾树各品种的可溶性蛋白含量变化如图5所示，随着低温胁迫的加剧，“滕选”5 号、北栾可溶性蛋白含量均呈现先上升后下降趋势，在-20℃含量高于其他胁迫温度。“滕选”4 号可溶性糖含量呈不断升高趋势但在最低温-25℃时含量仍未高于“滕选”5 号及北栾。在-5～-15℃低温处理阶段内，所有品种可溶性蛋白含量缓慢增加，-15～-20℃迅速增加，之后“滕选”5 号、北栾至-20℃快速升高后下降明显。“滕选”4 号呈持续增加趋势。增加幅度上，“滕选”4 号、5 号、北栾分别比最低对照增加了1252.39%（P＜0.01）、1467.90%（P＜0.01）、1086.51%（P＜0.01），均差异极显著。

图5 低温胁迫下不同栾树品种可溶性蛋白含量的变化/（mg·g-1）

2.4 低温胁迫下MDA 含量的变化

低温胁迫下，栾树各品种的MDA 含量变化如图6所示，随着低温胁迫的加剧，各栾树品种MDA含量均呈现先上升后下降趋势。其中，“滕选”4 号、5 号在-5～-15℃低温处理阶段内，含量升高，在-15℃之后下降。而北栾在-5～-20℃含量升高，自-20℃之后开始下降。各栾树MDA 含量开始下降温度都早于各品种的低温半致死温度。北栾MDA 含量开始下降温度晚于其他两品种。各品种MDA 含量最高值比对照分别增加了45.50%（P＜0.01）差异极显著、28.30%（P＜0.05）差异显著、51.47%(P＜0.01)差异极显著。

图6 低温胁迫下不同栾树品种MDA 含量的变化/（μmol·g-1）

3 讨论与结论

低温对膜的伤害主要表现在膜透性的改变，从而使细胞内物质大量向外渗透[14]。柳新红等研究表明电导率的变化体现出质膜受伤害程度以及所测材料的抗寒性大小，电解质渗出率达50%得出的半致死温度可以更加准确反映植物的抗寒性[15]。相对电导率越小，抗寒性越强，反之，抗寒性越弱[16]。随着温度降低，各品种相对电导率不断升高，“滕选”4号、5 号在-20℃已经达到51.91%、52.82%，北栾在-30℃达到50.25%，细胞膜受到严重损害，北栾到达50%电导率的胁迫温度更低，表明北栾相对“滕选”4 号、5 号更耐寒。通过Logistic 拟合回归方程计算得出各品种的半致死温度，3 种栾树的低温半致死温度由低到高分别为北栾-27.549℃、“滕选”4号-20.895℃、“滕选”5 号-18.723℃。3 种栾树抗寒性排序为北栾＞“滕选”4 号＞“滕选”5 号。2 个新选南栾无性系抗寒性仍未达到北栾水平，但从抗寒性来看，完全可以在山东省范围内栽培应用。

SOD 是植物细胞重要的保护酶，其活性高低与植物抗寒性强弱有密切关系[17]。本研究中，各品种SOD 活性均呈先下降再升高再下降趋势，在-5～-25℃低温处理阶段内的峰值在出现在-20℃，但变化趋势与王珊珊[1]不断升高、冯献宾[2]有所不同。

脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物体内低温胁迫下重要的渗透调节物质[14]。低温胁迫下大多数植物会通过积累渗透调节物质增加细胞液的浓度，降低渗透势，借此提升抗寒能力[18]。本次研究表明，随着低温胁迫加剧，脯氨酸含量“滕选”4 号、5号先降低后升高，北栾持续升高，北栾上升幅度最大；可溶性糖含量“滕选”4 号、5 号先升高后降低，北栾持续升高；可溶性蛋白“滕选”5 号、北栾先升高后降低，“滕选4 号持续升高。各品种渗透调节物质升高明显，表明了其面对低温胁迫的敏感性，低温处理阶段内渗透调节物质升高后降低说明低温胁迫对植物细胞造成了不可逆转伤害，生理机能下降。渗透调节物质的总体变化趋势与之前的研究变化相似[1,19]。

植物在逆境下细胞产生大量的自由基加剧细胞膜过氧化，使细胞膜破坏加剧。MDA 是脂膜过氧化的最终产物，是反映了细胞膜伤害的重要指标[20]。本试验MDA 含量呈先升高后降低趋势，表明低温超出试材的耐受能力，植物细胞受到伤害严重难以抵御严寒使生理机能紊乱MDA 下降。北栾开始下降温度在-20℃低于“滕选”4 号、5 号-15℃，表明其脂膜过氧化导致生理机能下降的温度低于 “滕选”4 号、5 号。MDA 含量都在低温半致死温度前开始下降，此结论和吕小军等[17]对花椒抗寒中MDA 的变化一致。

本文研究在室内通过人工降温实现的，各品种低温半致死温度作为参考，实际生产应用中3 个树种抗寒性可能与试验结果有一定误差，可根据实际情况综合判定。