α-法尼烯在巴斯德毕赤酵母中的生物合成

刘慧，陈胜玲，徐建中*，张伟国*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)

倍半萜类化合物在医药、化妆品、调味品和生物能源方面具有巨大的经济价值[1-2]。法尼烯是植物产生的最简单的无环倍半萜之一，在苹果皮中分布丰富[3]。但是，它的天然合成受到植物生长的严重限制，无法满足市场需求[4]。因此，研究人员已经努力设计微生物细胞工厂以生产法尼烯[5-9]。最近，已经在大肠杆菌[5]、酿酒酵母[6]和解脂耶氏酵母[7-9]中通过设计代谢工程来生产法尼烯。与这些宿主相比，巴斯德毕赤酵母表达系统成本低、周期短、表达量高且可高密度培养，具有大规模生产α-法尼烯的潜力。一些研究已经证明，巴斯德毕赤酵母是生产类异戊二烯的合适宿主[10]。然而，目前没有报道描述巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯的异源生产。

在本项研究中，首先成功构建了产α-法尼烯的巴斯德毕赤酵母重组菌株。然后揭示了巴斯德毕赤酵母甲羟戊酸途径和α-法尼烯合成途径中限速步骤。之后对限速酶组合过表达并优化基因拷贝数以平衡代谢途径逐步提高α-法尼烯产量。最后通过外源添加不饱和脂肪酸促进α-法尼烯分泌到细胞外，在摇瓶中最终获得α-法尼烯产量约1.40 g/L[0.32 g/g 细胞干重(dry cell weight，DCW)]。这些策略提供了增强巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯生产的有效方法，并为其他增值化学品的生物生产提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

酿酒酵母S288C、大肠杆菌DH5α、野生型巴斯德毕赤酵母X33、大肠杆菌-酵母穿梭质粒PGAPZA，购自Invitrogen。……