Npas4在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用及其可能机制*

石子璇， 饶 维， 姬广辉， 腰向颖△

（解放军总医院第六医学中心1中医内科，2神经外科，北京100048）

脑卒中是神经系统的常见急重症，其流行率、发病率和死亡率均较高，已成为我国居民的首要死因及成人首要致残原因［1-2］，而缺血性脑卒中在其中占比高达67.3%~80.5%［3］。尽管目前多种再灌注治疗手段（如溶栓、取栓及闭塞再通等）在临床广泛应用，但目前仍缺乏有效的临床干预靶点及神经保护药物［4-5］。神经元PAS结构域蛋白4（neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4，Npas4）是碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族中的一员，几乎仅表达于脑组织，参与调节抑制性突触发育及突触可塑性，在学习和记忆中发挥重要作用；同时，Npas4也是一种神经元兴奋相关的即早基因，与多种神经退行性疾病关系密切［5］。部分研究也揭示Npas4可减轻缺血性脑损伤，具有一定的神经保护作用［6］。然而，神经元氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）损伤后，Npas4的表达规律及其具体作用目前尚不清楚。本项工作拟构建小鼠原代皮层神经元OGD/R模型，观察损伤后Npas4的时间变化规律，并通过基因干预下调Npas4的表达，探讨其在神经元OGD/R损伤中的作用及其可能机制。

材料和方法

1 实验材料与主要试剂

C57BL/6孕鼠，孕14~15 d，22~25 g，SPF级，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物合格证编号为SCXK（陕）-2019-001。神经元培养液（Neuro⁃basal®、B27和GlutaMAX™）及Dulbecco改良Eagle培养 液（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher Scientific）；RNA提取、反转录及实时定量PCR试剂盒（TaKaRa）；细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8；上海生工生物工程公司）；Western blot试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗Npas4抗体（NeuroMab）；抗Homer1a抗体（Santa Cruz）；抗caspase-3和cleaved caspase-3抗体（Cell Signaling Technology）；无关序列（scramble）及Npas4短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒颗粒（上海吉凯基因化学技术有限公司）。……