利用CRISPR/Cas9系统构建猪PLIN1基因敲除载体及其效率检测

彭玥晗 ， 徐 磊 ， 许金蔓 ， 王 昊 ， 胡悦旻 ， 鞠辉明,2

(1.扬州大学兽医学院 ， 江苏 扬州 225009 ； 2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 ， 江苏 扬州 225009)

我国拥有丰富的地方猪种资源，近年来，在猪的肉质性状、生长性状、繁殖性状等方面与全基因组选择和全基因组关联分析方面取得了很多研究成果[1]。猪肉的生产效率及猪肉品质一直都是猪种选育的重点，在遗传上解析不同类型猪的肌肉生长发育差异，对猪种遗传差异的深入研究具有重要的指导意义[2]。围脂滴蛋白(Perilipin，PLIN)是最早由 Greenberg 等于小鼠的附睾脂肪细胞中发现的结构蛋白家族[3]，其中PLIN1定位于脂肪细胞脂滴表面，调节脂肪甘油三酯的储存和水解[4]。越来越多研究表明，PLIN1基因对肌肉生长发育、能量代谢及线粒体功能有调控作用。CRISPR/Cas9可以编辑多种基因功能，是目前实现基因突变效率最高的系统，该系统包括系统元件 sgRNA 和 Cas9 蛋白，利用该系统可以实现基因敲入、基因敲除、基因沉默以及各种目的基因的编辑[5-6]。本课题组前期在研究巴马猪、大白猪肌肉发育差异的过程中，利用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技术比较出PLIN1蛋白在巴马猪、大白猪肌肉组织蛋白中表达量差异显著。本试验拟利用CRISPR/Cas9系统构建猪PLIN1敲除载体，转染猪PK15细胞，富集crispr-sgRNA靶向切割引起的PLIN1基因突变或者外源碱基序列插入的细胞群，为后续研究该基因功能提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 猪肾上皮细胞系(PK15 细胞系)、基因敲除载体pYSY-CMV-Cas9-U6-sgRNA-EF1a-Puromycin为本实验室保存。……