乳腺癌组织和细胞中PIM-1与PD-L1表达水平的相关性分析

刘 慧，马东慎，刘广珍，向臣希

乳腺癌为严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一[1]。目前，随着肿瘤免疫治疗的发展，程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1, PD-L1)抑制剂对于难治性乳腺癌的疗效初现[2-3]。然而PD-L1的表达具有异质性和动态性[4]，乳腺癌中PD-L1的调控因素尚未明确。促癌因子莫洛尼病毒前病毒整合位点-1(proviral integration site of moloney virus-1, PIM-1)属于丝氨酸-苏氨酸激酶，在免疫系统调节中起重要作用[5]。研究表明PIM-1抑制剂能够促进三阴型乳腺癌细胞发生凋亡[6]，而PIM-1能否调控三阴型乳腺癌中PD-L1的表达尚未见文献报道。本文着重分析浸润性乳腺癌中PD-L1和PIM-1蛋白的表达及两者表达的相关性，并从细胞学水平初步证明PIM-1对PD-L1蛋白的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010～2016年徐州医科大学附属医院行根治性切除术且术后病理确诊为浸润性乳腺癌患者208例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。根据病理学资料获得其分子亚型信息，其中Luminal A型43例，Luminal B型47例，HER-2过表达型42例，三阴型76例。按照常规方法制备组织芯片。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化SP法染色，试剂盒购自北京中杉金桥公司。PIM-1抗体(克隆号G11)购自美国Santa Cruz公司。PD-L1抗体(克隆号22C3)购自美国DAKO公司。免疫组化使用Ventana全自动免疫组化系统进行。PIM-1阳性定位于肿瘤细胞胞核，呈黄色或棕黄色染色，采用免疫组化评分(H-Score)量化PIM-1的表达水平，以中位H-Score作为Cut off值将病例分为PIM-1高表达组和低表达组[7]。PD-L1阳性定位于肿瘤细胞或浸润的淋巴细胞和巨噬细胞，呈黄色或棕黄色染色。以CPS法对肿瘤PD-L1表达水平进行评分：CPS评分=[(阳性肿瘤细胞+阳性淋巴细胞+阳性巨噬细胞)/活肿瘤细胞总数]×100，统计一个高倍视野下的所有细胞(不少于100个肿瘤细胞)，将CPS评分≥10的病例作为PD-L1阳性病例。所有免疫组化结果均经两位病理医师进行评分。

1.2.2细胞培养与转染 乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，换液及传代按常规方法进行。PIM-1过表达载体和PIM1小干扰RNA(siPIM-1)由上海吉玛公司合成。细胞于6孔板分为4组培养，分别为过表达载体对照组、PIM-1过表达组、siPIM-1对照组以及siPIM-1组。培养至70%融合时使用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)按常规方法进行转染。

1.2.3qRT-PCR 使用PIM-1过表达载体和siPIM-1在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中对PIM-1进行过表达或敲减。转染完毕的各组细胞继续培养24 h弃去培养上清，每孔加入1 mL Trizol(美国Invitrogen公司)裂解细胞并按常规方法使用氯仿抽提法提取RNA。提取的总RNA使用琼脂糖电泳检测完整性并检测浓度和纯度后，使用M-MLV逆转录酶(南京诺维赞公司)进行逆转录反应。使用AceQ qPCR CYBR Green Master Mix试剂盒(南京诺维赞公司)于StepOne Plus荧光定量qPCR仪中进行qRT-PCR实验。引物由上海吉玛公司合成，PD-L1引物序列：上游5′-TGGCATTTGCTGAACG CATTT-3′，下游5′-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3′。

1.2.4Western blot法 使用PIM-1过表达载体和siPIM-1在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中对PIM-1进行过表达或敲减。转染完毕的各组细胞继续培养48 h后使用刮刀收取细胞。使用RIPA裂解液(北京碧云天公司)裂解细胞。按常规方法提取蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒(北京碧云天公司)进行蛋白定量并调整蛋白浓度。根据常规方法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行转膜，使用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜(PIM-1、PD-L1和GAPDH一抗稀释比均为1 ∶1 000；PIM-1一抗购自美国Santa Cruz公司，PD-L1、GAPDH一抗购自美国Abcam公司)，次日使用TBST洗涤后二抗室温孵育1 h，再次洗涤后使用化学发光法检测目的条带并使用Image J软件对条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1与PIM-1的表达208例乳腺癌根据乳腺癌分子分型分为Luminal A、Luminal B、HER-2过表达和三阴型。免疫组化结果显示，PIM-1呈胞核着色，PD-L1呈胞质和胞膜着色(图1)；PD-L1在三阴型乳腺癌中的阳性率为13.16%(10/76)，在Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型中的阳性率分别为4.65%(2/43)、2.12%(1/47)和4.76%(2/42，)，差异有统计学意义(χ2=4.779，P=0.029，表1)。不同分子分型乳腺癌组织中PIM-1表达水平差异无显著性(χ2=0.432，P=0.511，表2)。

图1 PD-L1与PIM-1在乳腺癌组织中的表达，SP法：A.1例乳腺癌组织高表达PD-L1；B.该例乳腺癌组织同时高表达PIM-1

表1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1的表达[n(%)]

表2 不同分子分型乳腺癌中PIM-1的表达[n(%)]

2.2 乳腺癌组织中PD-L1与PIM-1表达的相关性χ2检验结果显示，PIM-1高表达组中PD-L1的阳性率(12.50%，13/104)高于PIM-1低表达组(1.92%，2/104)。Fisher精确概率法分析显示，乳腺癌组织中PD-L1与PIM-1的表达呈正相关(P=0.006，表3)。

表3 乳腺癌中PIM-1表达与PD-L1表达的相关性[n(%)]

2.3 PIM-1对乳腺癌细胞中PD-L1表达的影响本组体外实验显示，PIM-1对乳腺癌细胞PD-L1表达水平有促进作用。qRT-PCR结果表明，在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中，过表达PIM-1显著提高PD-L1 mRNA水平，敲减PIM-1则导致其表达水平明显降低(图2)。Western blot法结果显示，在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中过表达PIM-1明显提高PD-L1的蛋白表达，敲减PIM-1则导致其表达水平明显降低(图3)。

图2 PIM-1对乳腺癌细胞系中PD-L1 mRNA表达水平的影响：乳腺癌细胞系MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)过表达PIM-1明显促进PD-L1 mRNA表达，敲减PIM-1则明显降低PD-L1 mRNA表达；*P<0.05，**P<0.01

图3 PIM-1对乳腺癌细胞系中PD-L1蛋白表达的影响：A.乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中过表达PIM-1明显促进PD-L1的表达，敲减PIM-1则明显降低PD-L1 mRNA表达；B.Western blot条带的灰度分析结果；**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

肿瘤免疫治疗是近年发展迅速的一种肿瘤治疗方法。免疫系统能够识别肿瘤相关抗原并能够调控机体内免疫细胞对肿瘤的杀伤，通过修复和增强机体的免疫系统，可以起到抑制肿瘤发生、发展作用[8]。然而，肿瘤在发生、发展过程中会获得“免疫逃逸”能力，即肿瘤细胞进入免疫抑制状态，失去对机体的免疫应答。这不仅是肿瘤逃脱免疫监视的原因，也是免疫治疗效果不佳的重要原因[9]。引起免疫逃逸的因素很多，在介导肿瘤免疫逃逸的分子中PD-L1最受关注。PD-L1为表达于肿瘤细胞表面重要的免疫抑制分子。肿瘤细胞可通过PD-L1与T细胞表面的PD-1分子结合诱导T细胞的凋亡，从而避免T细胞对肿瘤细胞的杀伤[10]。虽然阻断PD-L1通路在难治性乳腺癌的治疗中已获得初步成果，但PD-L1在三阴型乳腺癌中的表达具有异质性[11-12]，且并非所有患者均能从PD-L1抑制剂中获益，因此深入分析PD-L1调控的内在机制，对于寻找新的免疫治疗靶点进而解除肿瘤细胞的免疫抑制至关重要。

PIM-1激酶属于丝氨酸-苏氨酸激酶，是促癌因子PIM家族中的一员(PIM-1、2、3)，在免疫系统调节中起重要作用。在病毒诱发的淋巴瘤小鼠模型中发现，PIM-1基因存在病毒基因组的广泛插入，提示PIM-1的肿瘤驱动作用[13]。PIM-1异常激活与多种血液系统或上皮来源肿瘤相关。PIM家族所有成员基因的敲除并不影响正常细胞活性，故PIM-1正成为新的有潜力的抗肿瘤药物靶点[14]。泛PIM家族抑制剂已被批准临床I/II期实验，用于治疗急性骨髓性白血病、难治复发型前列腺癌以及复发型多发性骨髓瘤[15]。此外，有研究结果表明，PIM-1抑制剂能够促进三阴型乳腺癌细胞发生凋亡[6]。因此，PIM激酶作为乳腺癌治疗靶点具有一定的应用前景，值得深入分析。

本实验使用包含208例乳腺癌患者的组织芯片对PD-L1和PIM-1在乳腺癌组织中表达水平以及相关性进行分析，结果显示，PD-L1在三阴型乳腺癌中的阳性率高于其它分子分型的乳腺癌，Kruskal-Wallis统计检验显示差异有显著性。PIM-1在不同分子分型乳腺癌中的表达差异无显著性。相关性分析显示，PD-L1与PIM-1的表达水平呈正相关，PIM-1高表达的乳腺癌组织中PD-L1阳性率较高；提示PIM-1对PD-L1的表达具有正向调控作用。本实验在两种乳腺癌细胞系MCF-7(ER阳性)和MDA-MB-231(三阴型)中过表达PIM-1或使用siPIM-1敲减PIM-1，qRT-PCR和Western blot法检测结果显示，过表达PIM-1明显促进乳腺癌细胞中PD-L1的表达水平，敲减PIM-1则明显降低PD-L1的表达水平。对所有乳腺癌病例进行相关性分析和细胞实验中均未发现PIM-1对PD-L1的正向调控与乳腺癌分子分型相关，PD-L1在三阴型乳腺癌中较高的阳性率可能为其它独立因素引起。

本实验在乳腺癌组织中初步证明了PD-L1与PIM-1表达水平间存在正相关，并进一步在乳腺癌细胞株上验证了PIM-1对PD-L1表达的促进作用，提示PIM-1可正向调控PD-L1的表达。临床上乳腺癌免疫疗法作为靶向用药和化疗的补充疗法得到极大的关注。深入揭示乳腺癌组织中PD-L1的表达调控机制，为以PIM-1为靶点开发肿瘤免疫治疗药物提供了理论基础。