子宫内膜样癌中SIAH2的表达及临床意义

甄 娟，刘玉东，宋春红，吴 莎，焦瑞芬

子宫内膜癌是一种常见的女性恶性肿瘤，位居女性生殖系统恶性肿瘤的第2位，全球每年新确诊患者约319 600例。子宫内膜癌最常见的病理类型为子宫内膜样癌，约占总病例的85%[1-2]。随着临床诊疗水平的提高，早期(Ⅰ/Ⅱ期)子宫内膜样癌患者在接受手术和辅助化疗后的5年生存率可达85%，但晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者的治疗效果仍不容乐观，5年生存率仅达15%[3]。近年针对基因改变的靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中由于效果显著和副作用小，逐渐成为一些恶性肿瘤的主要治疗方法。因此，识别并鉴定子宫内膜样癌发生、发展的相关基因，不仅有助于预测肿瘤的生物学行为以及评估患者的预后，而且也有利于临床开发诊断相关基因的靶向治疗方案，从而提高患者的生存率和延长患者的生存时间。SIAH2作为一种E3泛素连接酶，研究发现其在卵巢上皮性癌和乳腺癌等女性恶性肿瘤中发挥促癌作用，与患者预后密切相关[4-5]。目前，SIAH2在子宫内膜样癌中的研究和作用尚不明确。本文旨在探讨SIAH2在子宫内膜样癌中的表达及临床意义，评估其在子宫内膜样癌患者预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2013年1月～2020年1月河北省石家庄市第四医院妇科行诊断性刮宫和手术切除的子宫内膜标本206例，其中癌旁正常子宫内膜40例，子宫内膜非典型增生50例，子宫内膜样癌116例，所有患者术前均未接受放、化疗及其他治疗。病理诊断结果根据WHO(2014)子宫内膜肿瘤分类标准明确诊断。组织离体后取少量立即放入液氮后移入-80 ℃冰箱保存，以备qRT-PCR和Western blot检测。所有标本的使用均通过本院伦理委员会审核及患者知情同意。

1.2 试剂免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂，均购自福州迈新公司。Fast Quant RT Kit试剂盒购自天根生化公司，GO Taq qPCR Master Mix试剂盒购自Promega公司，PCR引物合成委托上海生工公司进行。鼠抗人SIAH2抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin抗体购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 采用免疫组化SP法染色，标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。按试剂盒说明书步骤进行染色，SIAH2(抗体浓度1 ∶200)，PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。染色结果由两名有经验的中级以上病理医师阅片审核，SIAH2蛋白在细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机选取5个高倍视野(400×)，每个视野计数200个肿瘤细胞。(1)按阳性细胞百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。(2)按细胞着色强度计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。将上述两项得分结果相乘：<3分为阴性，≥3分为阳性。

1.3.2qRT-PCR 采用qRT-PCR法对SIAH2 mRNA进行定量检测。采用Trizol试剂提取30对子宫内膜样癌及癌旁正常子宫内膜组织总RNA，利用Fast Quant RT Kit试剂盒反转录获得cDNA，在ABI 7500上利用GO Taq qPCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR分析，实验至少重复3次，结果取平均值。SIAH2 PCR引物序列：上游5′-AGCATCAGGAACCT GGCTAT-3′；下游5′-CTGGTTTCTCCGTATGGTGC-3′。内参18S PCR引物序列：上游5′-CGCCGCTAGAGG TGAAATTC-3′；下游5′-CCAGTCGGCATCGTTTAT GG-3′。

1.3.3Western blot法 采用Western blot法检测SIAH2蛋白定量。收集30例子宫内膜样癌及30例配对的癌旁正常子宫内膜组织，加入裂解液，粉碎匀质后，低温高速离心(4 ℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清即为总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳、转印，脱脂奶粉封闭2 h，抗SIAH2(1 ∶150)、抗β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育过夜，ECL发光。Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值，将目的蛋白与β-actin光密度值作为相对表达量。实验至少重复3次，结果取平均值。

1.4 随访采用患者门诊复查及电话随访，平均每6个月1次，开始时间为手术时间，终止时间为患者死亡时间。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法。定量资料采用t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及Log-rank检验比较总生存率的组间差异。Cox比例风险模型筛选子宫内膜样癌患者预后的独立预测因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜组织中SIAH2的表达SIAH2阳性定位于细胞核(图1)。在癌旁正常子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样癌组织中，SIAH2阳性率分别为7.50%(3/40)、42.00%(21/50)和74.14%(86/116)，差异有统计学意义(χ2=56.524，P<0.001)。SIAH2表达与子宫内膜样癌FIGO分期、肌层浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)，与患者年龄和组织学分级无关(P>0.05，表1)。

图1 SIAH2在不同子宫内膜组织中的表达，SP法；A.癌旁正常子宫内膜组织中SIAH2呈阴性；B.子宫内膜非典型增生组织中部分细胞SIAH2呈核阳性；C.子宫内膜样癌中SIAH2呈弥漫强阳性

表1 子宫内膜样癌中SIAH2的表达与临床病理特征的关系

2.2 子宫内膜样癌中SIAH2的表达qRT-PCR和Western blot结果显示，与30对癌旁正常子宫内膜相比，子宫内膜样癌组织中SIAH2 mRNA和蛋白的相对表达量均明显升高。mRNA相对表达量分别为21.38±0.76、23.74±0.97，差异有统计学意义(t=-10.541，P<0.001，图2A)；蛋白相对表达量分别为0.25±0.05、0.92±0.10，差异有统计学意义(t=-24.912，P<0.001，图2B)。

图2 SIAH2在癌旁正常子宫内膜和子宫内膜样癌组织中的表达：A.qRT-PCR检测，***P<0.001；B.Western blot法检测；N1、N2：癌旁正常子宫内膜组织；C1、C2：子宫内膜样癌组织

2.3 SIAH2表达与子宫内膜样癌患者预后的关系生存分析结果显示，SIAH2阳性和阴性患者的5年平均生存时间分别为44、56个月；5年中位生存时间分别为54、60个月。SIAH2阳性患者的生存时间显著低于阴性患者，差异有统计学意义(χ2=13.129，P<0.001)，单因素分析结果表明，SIAH2表达、FIGO分期(χ2=9.406，P=0.002)、肌层浸润深度(χ2=6.209，P=0.013)及淋巴结转移(χ2=8.633，P=0.003)与子宫内膜样癌患者的总生存期相关(表2，图3)；Cox多因素分析结果显示，SIAH2阳性也是子宫内膜样癌患者预后差的独立危险因素(表3)。

图3 Kaplan-Meier分析子宫内膜样癌临床病理因素与患者总生存率的关系：A.SIAH2表达；B.肌层浸润深度；C.FIGO分期；D.淋巴结转移

表2 子宫内膜样癌总生存率的单因素分析

表3 子宫内膜样癌总生存率的多因素分析

3 讨论

近年子宫内膜癌的发病率急剧上升。恶性肿瘤的早期准确诊断对于癌症患者的治疗和预后至关重要[6-7]。因此，寻找子宫内膜癌发生、发展过程中相关基因的改变，既有助于该疾病的早期诊断，也为未来的靶向治疗提供靶点。

E3泛素连接酶SIAH与果蝇属SINA的氨基酸同源性达83%以上，其生物学活性对信号转导通路至关重要。果蝇SINA及其人类同源的SIAH1和SIAH2蛋白具有4个高度保守的功能结构域，属于RING结构域E3泛素连接酶家族。这些结构域包括环RING结构域(E3泛素连接酶活性的催化活性位点)、SIAH型锌指(SZF，包含一个双锌指基序)、SBS(底物结合位点)和二聚结构域(二聚化)。SINA/SIAH1/SIAH2作为一种E3连接酶，能够相互作用、修饰和靶向作用于多种底物，协调泛素介导的蛋白质水解，从而调节蛋白质的稳定性、蛋白质复合体的组装、蛋白质的亚细胞定位以及其他人类正常发育和疾病中细胞的功能。SIAH2作为该家族的重要成员，具有高度发散和扩展的N端序列，在信号转导通路、低氧反应、线粒体生物合成、细胞生存、多种肿瘤的发生和进展过程中发挥重要的促进作用[8-11]。研究发现SIAH2在喉鳞状细胞癌中高表达，随着肿瘤分化程度的降低和临床分期的升高，SIAH2的表达显著增加，并且SIAH2的表达与喉鳞状细胞癌淋巴结转移及患者预后密切相关[12]。Qi等[13]在鼠黑色素瘤中研究发现，抑制SIAH2活性后，通过上调底物蛋白Spry2降低P-ERK的表达，或通过PHD3降低HIF-1α表达，抑制肿瘤的生长和转移，促进肿瘤细胞凋亡。Ahmed等[14]在4种肺癌细胞系中亦发现，转染SIAH2-shRNA抑制SIAH2表达后，通过降低P-ERK的表达抑制肺癌细胞的生长和增殖，促进肺癌细胞凋亡，软琼脂菌落形成实验结果亦发现，抑制SIAH2后，肺癌A549细胞形成菌落的大小和数量明显减少，细胞凋亡增加；动物实验结果亦发现，敲低SIAH2表达后裸鼠原发肿瘤的体积和重量显著降低；提示SIAH2与细胞增殖凋亡密切相关。Schmidt等[15]发现，抑制SIAH2的表达可抑制Ras介导的成纤维细胞的恶性转化及裸鼠胰腺癌细胞的生长，而且在两种含有致癌K-Ras基因的胰腺癌细胞系中，SIAH2的缺失导致P-ERK的表达降低，推测SIAH2或SIAH2的底物蛋白有可能是人胰腺癌细胞Ras/Raf/ERK/MAPK信号通路调节反馈环的一部分。SIAH2通过干扰Ras信号通路，从而抑制肿瘤的生长和增殖。

本实验发现，SIAH2蛋白的阳性率在癌旁正常子宫内膜→子宫内膜非典型增生→子宫内膜样癌组织中逐渐升高，SIAH2 mRNA和蛋白相对表达量在子宫内膜样癌中也明显增高，提示在子宫内膜样癌癌变过程中，SIAH2可能作为肿瘤促进因子发挥作用。同时实验结果亦显示，SIAH2表达与子宫内膜样癌FIGO分期、肌层浸润深度和淋巴结转移呈正相关，提示SIAH2与子宫内膜样癌的恶性生物学行为密切相关。生存分析发现，SIAH2阳性患者较阴性患者的5年生存率明显下降，生存时间也明显缩短。Cox多因素分析发现，SIAH2是子宫内膜样癌患者的危险因素，提示SIAH2可能与子宫内膜样癌患者的不良预后有关。

综上所述，SIAH2作为癌基因在子宫内膜样癌生物学过程中发挥重要作用，高表达的SIAH2与子宫内膜样癌发生、发展和转移等恶性行为及患者的不良预后密切相关，SIAH2有望成为子宫内膜样癌早期诊断标志物和潜在的药物治疗靶点，并为临床评估患者预后提供理论依据。